[[alternative]]Synthesis of functional cyclic guanidino derivatives and their application in the signal enhancement of mass spectrometer

碩士[[abstract]]微量蛋白質的偵測，在蛋白質體學研究中是非常具挑戰的主題。利用化學法修飾生物分子的帶電性，進而提升質譜訊號的靈敏度，則是目前具有潛力的解決方法之ㄧ。其中以胍基衍生物來修飾的胜肽，則是最值得注意的。然而其化學修飾物之官能基與訊號強度之間的關係並未探討。本論文將利用開發出新的環化合成方法，來製備出具推電子基、五環、六環、氫氧基及掌性異構之不同功能性之試劑，再與胜肽中離胺酸耦合成一系列的胍基衍生物，經由NMR 鑑定，高效能液相層析儀分析，及LC-MS/MS 確認這些胍基衍生物的形成。利用基質輔助雷射脫附游離質譜，將胰蛋白酶水解之肌紅蛋白中的ㄧ段胜肽與化學試劑耦合之結構與訊號強度之間的探討。經比對結果顯示，六環結構於質譜訊號強化15.1 倍、五環強化9.2 倍、推電子基強化12.3 倍、氫氧基強化7.6 倍與掌性異構強化12.3-12.4 倍。此結果顯示出，電荷的穩定性對訊號靈敏度的提升，具有決定性的影響，對後續研發ICAT 與iTRAQ 等蛋白質定量試劑具有相當重要的指標意義。[[abstract]]Detection of low abundant proteins is one of challenging topics in proteomics. Guanidino group was demonstrated to enhance the signal instensity in MALDI experiments. This report described a novel synthetic pathway to prepare the cyclic guanidino derivatives. The guanidino moiety was generated by O-ethylisourea and amino group of lysine-specific side chain. The characterization and identification was performed by NMR, HPLC, LC-MS/MS and MALDI. The result suggested the stabilization of positive charge at guanidino group plays an important role in signal enhancement of mass spectra of proteins. These results provide a further application in the ICAT and iTRAQ for protein quantification.[[tableofcontents]]目錄 中文摘要...................................................I 英文摘要..................................................II 目錄.....................................................III 圖目錄....................................................VI 表目錄...................................................VII 附圖目錄................................................VIII 第一章 緒論 1-1 前言...................................................1 1-2 質譜應用在蛋白質身份鑑定介紹...........................2 1-2-1 胜肽指紋鑑定.........................................3 1-2-2 串聯式質譜法鑑定蛋白質身份...........................4 1-3 化學法修飾應用在質譜訊號強化...........................6 1-3-1 化學修飾胜肽標記的介紹...............................7 1-4 功能性環化胍衍生物的合成背景...........................9 第二章 實驗步驟 2-1 材料與方法............................................13 2-2 訊號試劑環化合成步驟與產率計算........................19 2-3 胜肽合成的步驟........................................24 2-4 胍基合成反應實驗步驟..................................28 2-5 高效能液相層析分離純化方法............................30 第三章 結果與討論 3-1 原理介紹..............................................32 3-1-1 固相胜肽合成法......................................32 3-1-2 基質輔助雷射脫附游離原理............................43 3-1-3 微波促進反應合成方法................................43 3-1-4 高效能液相層析法....................................46 3-2 設計合成概念..........................................47 3-2-1 化學修飾合成設計....................................47 3-2-2 胜肽序列合成設計....................................48 3-2-3 合成通式............................................49 3-3 訊號試劑合成反應......................................50 3-4 胜肽序列合成反應......................................52 3-5 胍基合成反應討論......................................53 3-6 胜肽修飾與定量之討論..................................56 3-7 訊號試劑的分離與純化..................................56 3-8 不同訊號輔助試劑之間的訊號差異結果....................57 3-9 未來設計衍生概念與應用................................59 3-10 結論.................................................60 參考文獻..................................................62 光譜附錄..................................................65 圖目錄 圖1、蛋白質體學的研究流程圖................................2 圖2、胜肽片段之序列斷裂流程示意圖..........................4 圖3、離子碎片的命名法......................................5 圖4、訊號試劑於質譜應用前後差異............................6 圖5、胜肽化學修飾位置之pKa 標示圖..........................7 圖6、胍基的pKa 值與MALDI 質譜儀訊號間的關係...............10 圖7、胍基與串聯式質譜儀訊號間的關係.......................11 圖8、多步合成2-甲烷氧- 4,5-二氫-1H-咪唑反應流程...........12 圖9、DCC 耦合反應機構.....................................37 圖10、茚三酮的反應機制....................................39 圖11、固相胜肽合成圖......................................40 圖12、Fmoc 樹脂切除試劑選擇流程圖.........................41 圖13、固相胜肽合成實驗流程圖..............................42 圖14、基質輔助雷射脫附游離質譜示意圖......................43 圖15、微波頻率的界定......................................44 圖16、傳統傳導加熱與微波加熱示意圖........................45 圖17、合成設計概念........................................47 圖18、合成設計通式........................................49 表目錄 表1、胜肽胺基化學修飾優缺點比較............................9 表2、HPLC 之梯度沖提溶劑與滯留時間條件分配................30 表3、樹脂顆粒大小.........................................34 表4、不同訊號試劑合環反應產率表...........................50 表5、胺基酸合成胜肽序列反應產率表.........................52 表6、訊號試劑與序列GAKWG 耦合反應產率.....................55 表7、訊號試劑應用質譜計算訊號相對強度差異.................58 附圖目錄 附圖1、化合物1 之1H NMR (300 MHz, CDCl3)..................65 附圖2、化合物1 之13C NMR (75.4 MHz, CDCl3)................66 附圖3、化合物1 之ESI-TOF MS 圖譜..........................67 附圖4、化合物2 之1H NMR (300 MHz, D2O)....................68 附圖5、化合物2 之ESI-TOF MS 圖譜..........................69 附圖6、化合物3 之1H NMR (300 MHz, CDCl3)..................70 附圖7、化合物3 之13C NMR (75.4 MHz, CDCl3)................71 附圖8、化合物3 之ESI-TOF MS 圖譜..........................72 附圖9、化合物4 之1H NMR (300 MHz, D2O)....................73 附圖10、化合物4 之13C NMR (75.4 MHz, D2O).................74 附圖11、化合物4 之ESI-TOF MS 圖譜.........................75 附圖12、化合物5 之1H NMR (300 MHz, CDCl3).................76 附圖13、化合物5 之13C NMR (75.4 MHz, CDCl3)...............77 附圖14、化合物5 之ESI-TOF MS 圖譜.........................78 附圖15、化合物6 之1H NMR (300 MHz, CDCl3).................79 附圖16、化合物6 之ESI-TOF MS 圖譜.........................80 附圖17、化合物7 之1H NMR (300 MHz, D2O)...................81 附圖18、化合物7 之13C NMR (75.4 MHz, D2O).................82 附圖19、化合物7 之ESI-TOF MS 圖譜.........................83 附圖20、化合物8 之1H NMR (300 MHz, D2O)...................84 附圖21、化合物8 之13C NMR (75.4 MHz, D2O).................85 附圖22、化合物8 之ESI-TOF MS 圖譜.........................86 附圖23、化合物9 之1H NMR (300 MHz, D2O)...................87 附圖24、化合物10 之1H NMR (300 MHz, D2O)..................88 附圖25、化合物10 之MALDI-TOF MS 譜圖......................89 附圖26、化合物9 與化合物1 耦合加熱反應之NMR 分析圖........90 附圖27、化合物9 與化合物1 耦合加熱50 ℃反應19 小時之ESI-MS 譜圖......................................................91 附圖28、化合物10 與化合物1 耦合微波加熱溫度測試反應之NMR 分析圖....................................................92 附圖29、化合物10 與化合物1 耦合微波加熱時間測試反應之NMR 分析圖....................................................93 附圖30、化合物10 與化合物1 耦合微波加熱80 ℃反應50 分鐘 之ESI-MS 譜圖.............................................94 附圖31、化合物1 與化合物9 耦合反應之LC-MS/MS 圖譜.........95 附圖32、化合物2 與化合物9 耦合反應之LC-MS/MS 圖譜.........96 附圖33、化合物3 與化合物9 耦合反應之LC-MS/MS 圖譜.........97 附圖34、化合物4 與化合物9 耦合反應之LC-MS/MS 圖譜.........98 附圖35、化合物6 與化合物9 耦合反應之LC-MS/MS 圖譜.........99 附圖36、化合物7 與化合物9 耦合反應之LC-MS/MS 圖譜........100 附圖37、不同訊號試劑之高效能液相層析分離圖譜.............102 附圖38、化合物9 之高效能液相層析分離.....................102 附圖39、化合物11 之MALDI-TOF/TOF 譜圖....................103 附圖40、化合物1、5 分別與化合物11 耦合測MALDI-TOF/TOF譜圖..104[[note]]學號: 694170308, 學年度: 9