[[alternative]]I.yeast two-hybrid screening of saccharomyces cerevisiae JHD1. II. heterologous expression and purification of nattokinase from bacillus subtilis TKU007

碩士[[abstract]]第I部分： 應用高效率電穿孔法於酵母菌的雙雜合篩選， JHD1/YER051W為啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae) BY4742 上的一段ORF，為去甲基酶；將JHD1 ORF接上BD載體，作為【餌】，由已接上 AD載體之酵母基因的基因庫，作為【魚】。送入啤酒酵母菌 PJ69-4A中，會彼此相互結合的蛋白質就能在篩選的特定培養基中表現出來。再把篩選出的基因作進一步分析，可以瞭解到該蛋白之功能與特性。目前在JHD1/YER051W 的酵母菌雙雜合篩選實驗中，已篩選出的基因為CIN5/YOR028C。 第II部分： Bacillus subtilis TKU007中含有的納豆激酶基因，前面另有一段含有77個胺基酸的propeptide，為蛋白原轉變成活性蛋白質過程中去除的肽段。本研究利用PCR (聚合酶鏈反應)大量生產含有propeptide的納豆激酶基因片段( pronattokinase )與納豆激酶基因片段(nattokinase)，並在兩者的C ’端接上His•Tag coding sequence後，轉型到pYES2表現載體上進行異源表現，使用半乳糖去誘導產生蛋白質，及其蛋白質表現後的純化。[[abstract]]In part I, high efficiency transformation by electroporation is applied to yeast two¬- hybrid screening. JHD1/YER051W is a demethylase gene from Saccharomyces cerevisiae BY4742. The JHD1/YER051W ORF is ligated to the BD vector as the “bait”. Appropriate DNA library constructed on the AD vector was screened for “fish” when the library was transformed into yeast PJ69-4A. The interacting proteins expressed from the AD vector would be selected in the specific medium. Afterwards, more functional analysis will be done to further understand the functional role of the interacting proteins. In this study, JHD1 was found to interact with CIN5/YOR028C gene product using the yeast two-hybrid screening. In part II, a nattokinase from Bacillus subtilis TKU007 was investigated. Propeptide, which is 77 amino acids fragment at the N terminus of the nattokinase, is required to convert pronattokinase to the mature active nattokinase. The propeptide is then cleaved off by the mature nattokinase. In this research, we used PCR (polymerase chain reaction) to clone pronattokinase and nattokinase sequence, respectively. Both of them are linked to His•Tag coding sequence at their C termini, and ligated to the expression vector pYES2. Heterologous expression in yeast was induced by galactose, and the over-expressed protein was purified .[[tableofcontents]]目錄 謝誌 I 中文摘要 II 英文摘要 IV 英文縮寫對照表 V 目錄 VI 圖表目錄 XI 第一部分 啤酒酵母菌JHD1之酵母菌雙雜合篩選 第一章 緒論…………………………………………………………...1 第一節 酵母菌之簡介..…………………………………………………………..1 第二節 酵母菌雙雜合（yeast two-hybrid）之介紹…..………………………....1 第三節 電穿孔之介紹…………………………………………………………. ...2 第四節 JHD1介紹……………………………………………………………......3 第五節 研究動機………………………………………………………………….3 第二章 材料與方法…………………………………………………......4 第一節 重組DNA製備…………………………………………………..……....4 1.1.模板( template )製備………………………………………………………...4 1.2.聚合酶鏈鎖反應( PCR )大量複製目標基因 JHD1/YER051W ………….5 1.2.1. primer設計…………………………………………………………….5 1.2.2. 聚合酶連鎖反應( polymerase chain reaction, PCR )………..………..6 1.3. DNA瓊脂凝膠電泳分析(Agarose gel electrophoresis)……………….....8 1.4. PCR 切膠純化……………………………………………………………8 1.5. 補A鹼基………………………………………………………….………9 1.6. 基因選殖（TA- cloning）………………………………………………10 1.7. 大腸桿菌DH5α勝任細胞( competent cell )的製備...................……….11 1.8. E.coli transformation ( 大腸桿菌的質體轉型)…………….……… 12 1.9. 少量質體DNA的製備………………………………………………….13 1.10. 用限制酶處理確認 plasmid DNA（pGEM-T-JHD1）…..…………....14 1.11. 定序...…………………………………………………………………….14 1.12. 選殖基因之限制酶切位…………………………………………………15 1.13.選殖基因JHD1與表現載體pGBDU-C1之接合 ……………………...16 1.14. 大腸桿菌轉型，轉型至DH5α 勝任細胞……………………………...17 1.15. 利用限制酶確認片段以篩選正確之plasmid DNA ……………………17 1.16. 台大醫學院定序…………………………………………………………18 1.16.1. 引子設計……………………………………………………………….18 1.16.2. 聚合酶連鎖反應( polymerase chain reaction, PCR )………………….18 1.16.3. 台大醫學院定序方法………………………………………………….20 第二節 酵母菌轉型……….....................................................................................21 2.1. 小量酵母菌轉型（第一次轉型）...............................................................21 2.2. 大量酵母菌轉型（第二次轉型）...............................................................22 2.3. 轉盤………………………………………………………………………..24 2.4. 抽取酵母菌genomic DNA……………………………………………….25 2.5.大腸桿菌DH5α勝任細胞（competent cell）之配製--電破轉型法..........26 2.6. 大腸桿菌之質體轉型（transformation）--電破轉型法……………….27 2.7.質體DNA的製備…………………………………………………………...27 2.8. 利用限制酶處理（digestion）確認質體DNA ………………………….28 2.9. 台大醫學院定序…………………………………………………………..29 第三節CIN5/YOR028C的〝偽陽性〞判別 (反向篩選)………………………..30 3.1.載體交換.........................................................................................................30 3.2. CIN5與JHD1基因之限制酶切位............................................................30 3.3. 選殖基因CIN5, JHD1與表現載體pGBDU-C3,pGAD-C1之接合……31 3.4. 大腸桿菌轉型，轉型至DH5α 勝任細胞……………………………….32 3.5.利用限制酶確認片段以篩選正確之plasmid DNA ……………………...32 3.6.小量酵母菌轉型（第一次轉型）…………………………………………33 3.7.大量酵母菌轉型（第二次轉型）…………………………………………34 3.8. 塗盤………………………………………………………………………..34 第三章 結果與討論……………………………………………………35 第一節 重組DNA製備………………………………………………………….35 1.1. 聚合酶鏈鎖反應（PCR）結果………………………………………….35 1.2. TA-cloning確認結果……………………………………………………..35 1.3. 建構選殖基因之限制酶切位確認結果………………………………….36 1.4. 確認接合後之產物……………………………………………………….37 1.5.接合後產物定序……………………………………………………………..37 第二節JHD1 -pGBDU -C1 之第二次酵母菌轉型篩選結果…..…………….38 2.1. 電破轉型達到之效率…………………………………………………….39 2.2. 長出顆數………………………………………………………………….40 2.3. 轉盤過程………………………………………………………………….41 2.4. 以限制酶Hind III處理確認結果……………………………………….43 2.5. 比對篩選出之基因結果………………………………………………….44 第三節 CIN5/YOR028C的〝偽陽性〞判別 (反向篩選)………………….. ..45 3.1. CIN5與JHD1基因之限制酶切位確認結果…………………………….45 3.2. 確認接合後之產物……………………………………………………….46 3.3. 轉盤與塗盤結果………………………………………………………….47 第四章 結論…………………………………………………………...52 第二部分Bacillus subtilis TKU007 納豆激酶之異源表現與純化 第一章緒論…………………………………………………………….53 第一節 菌種介紹………………………………………………………………...53 第二節 納豆激酶………………………………………………………………...53 第三節 Propeptide ……………………………………………………………….53 第四節 His-tag …………………………………………………………………...54 第五節 Kozak sequence…………………………………………………………..54 第六節 實驗動機…………………………………………………………………54 第二章 實驗材料與方法………………………………………………55 第一節 重組DNA製備 (第一次)…………………………………………...….55 1.1 模板( template )製備…………………………………………………..…..55 1.2.聚合酶鏈鎖反應( PCR )大量複製目標基因 pro-NK與NK……………...56 1.2.1. primer設計………………………………………………………...….56 1.2.2. 聚合酶連鎖反應( polymerase chain reaction, PCR ) ……………......57 1.3. DNA瓊脂凝膠電泳分析 (Agarose gel electrophoresis)…………..….. 58 1.4. PCR 切膠純化………………………………………………………..…...58 1.5. 補A鹼基……………………………………………………………..…...59 1.6. 基因選殖（TA- cloning）………………………………………..……...59 1.7. 大腸桿菌DH5α勝任細胞( competent cell )的製備……………………..60 1.8. E.coli transformation ( 大腸桿菌的質體轉型) …………………..…60 1.9. 少量質體DNA的製備…………………………………………………....60 1.10. 用限制酶處理確認 plasmid DNA（pro-NK、NK）.............................60 1.11. 台大醫學院定序……………………………………………………….…61 1.12. 選殖基因之限制酶切位.............................................................................62 1.13.選殖基因pro-NK、NK與表現載體pET-26b(+)之接合………………..63 1.14. 大腸桿菌轉型，轉型至DH5α 勝任細胞……………………………....63 1.15. 利用限制酶確認片段以篩選正確之plasmid DNA ………………….….64 第二節 重組DNA的製備 (第二次)……………………………………………..65 2.1. 模板( template )製備…………………………………………………….…65 2.2. 聚合酶鏈鎖反應大量複製目標基因( pro-NK)- His•Tag與NK-His•Tag ……………………………………………………………………….65 2.2.1. primer設計………………………………………………………….…65 2.2.2. 聚合酶連鎖反應( polymerase chain reaction, PCR )…………….….. 66 2.3. DNA瓊脂凝膠電泳分析 (Agarose gel electrophoresis) ………….…….67 2.4. PCR 切膠純化……………………………………………………………..68 2.5. 補A鹼基……………………………………………………………….….68 2.6.基因選殖（TA- cloning）…………………………………………….……69 2.7. 大腸桿菌DH5α勝任細胞( competent cell )的製備……………………...69 2.8. E.coli transformation ( 大腸桿菌的質體轉型) ………………….….69 2.9. 少量質體DNA的製備…………………………………………………….69 2.10. 用限制酶處理確認 plasmid DNA（(pro-NK)- His•Tag、NK-His•Tag）..70 2.11. 台大醫學院定序………………………………………………………….70 2.12. 選殖基因之限制酶切位 ………………………………………………...71 2.13. 選殖基因(pro-NK)- His•Tag、NK-His•Tag與表現載體pYES2之接合..72 2.14. 大腸桿菌轉型，轉型至DH5α 勝任細胞……………………………….73 2.15. 利用限制酶確認片段以篩選正確之plasmid DNA ………………….….73 第三節 蛋白質表現與純化重組蛋白…………………………………………….74 3.1. 酵母菌轉型………………………………………………………………...74 3.2. 目標蛋白質的表現………………………………………………….……..75 3.3. 分析粗抽蛋白質……………………………………………………..…….76 3.3.1. SDS-PAGE 膠體電泳法 ……………………………………….….……76 3.3.2. 利用超音波細胞破碎機破菌………………………………….….……..78 3.4. 純化蛋白質……………………………………………………….….…….78 第三章 結果與討論……………………………………………………80 第一節 重組DNA的製備 (第一次)………………….. ………………………..80 1.1. 聚合酶鏈鎖反應（PCR）結果…………………………………………..80 1.2. TA-cloning確認結果 ……………………………………………………..80 1.3. 建構選殖基因之限制酶切位確認結果 ………………………………….81 1.4. 確認接合後之產物………………………………………………………..82 第二節 重組DNA的製備 (第二次) ……………………………………………..83 2.1. 聚合酶鏈鎖反應（PCR）結果…………………………………………..83 2.2. TA-cloning確認結果………………………………………………………84 2.3. 建構選殖基因之限制酶切位確認結果……………………………….…..85 2.4. 確認接合後之產物 ………………………………………………….….86 第三節 蛋白質表現與純化重組蛋白……………………………………….…87 3.1. 確認轉型至酵母菌BJ2168 後之質體DNA ……………………….….87 3.2. 目標蛋白質表現…………………………………………………….…..87 3.3. 純化目標蛋白質與SDS-PAGE分析蛋白表現……………………...…..90 第四章結論………………………………………………………...….92 參考文獻…………………………………………………………..…..93 附錄……………………………………………………………….…...95 附錄一、 Single-stranded carrier DNA 製備………………………….….….95 附錄二、 pGEM-T Easy Vector 特徵圖………………………………..…...96 附錄三、 pGBDU-C(X)載體與pGAD-C(X)載體之特徵圖………….….....97 附錄四、 pET-26 vector圖………………………………………………..….98 附錄五、 pYES2圖……………………………………………………..……99 附錄六、 Dropout powder 的營養成分及濃度表……………………...….100 附錄七、DNA ladder對照濃度圖………………………………………...…101 附錄八、 實驗儀器……………………………………………………..…..102 圖表目錄 圖一：yeast two hybrid 示意圖 …………………………………………………....2 圖二：pGAD載體，以限制酶Hind III作用之切位示意圖 ………………….... 29 圖三：pGBDU-C1-JHD1、 pGAD-C3-CIN5示意圖……………………….…..30 圖四：JHD1之PCR結果................................................…………….…………....35 圖五：insert：JHD1與pGEM-T Easy Vector用限制酶確認之結果 ………….…36 圖六：insert DNA：JHD1與pGBDU -C1 Vector用限制酶切下切位之結果…....36 圖七：JHD1 與pGBDU -C1 Vector接合完後再用限制酶確認接合是否正確之結果………… ………………………………………………………………………..37 圖八： JHD1- check frame (A)的PCR結果......................................…………….38 圖九：定序結果比對示意圖………………………………………………………38 圖十：有表現之菌落轉盤至SC-Ura/-Leu/-Ade（不含sorbitol）之固態培養基..41 圖十一：有表現之菌落從SC-Ura/-Leu/-Ade轉盤至SC-Ura/-Leu（不含sorbitol）之固態培養基 …………………………………………………………………….41 圖十二：有表現之菌落從SC-Ura/-Leu轉盤至SC-Leu（不含sorbitol）之固態培養基…………………………………………………………………………………42 圖十三：有表現之菌落從SC-Leu轉盤至SC-Leu+5-FOA（不含sorbitol）之固態培養基………………………………………………………………………………42 圖十四：用限制酶確定所要之質體DNA，編號：154 ........................................ 43 圖十五：比對篩選出之基因結果…………………………………………………44 圖十六：insert DNA：CIN5與pGBDU-C3 Vector用限制酶切下切位之結果…..45 圖十七：insert DNA：JHD1與pGAD- C1 Vector用限制酶切下切位之結果…...45 圖十八：JHD1與pGAD- C1 Vector接合完後再用限制酶確認接合是否正確之結果.................................................................................................................................46 圖十九：CIN5 與pGBDU -C3 Vector接合完後再用限制酶確認接合是否正確之結果.............................................................................................................................47 圖二十：CIN5 -pGBDU -C3的SC-Ura/-Leu 與SC-Ura/-Leu /-Ade比較結果...48 圖二十一：CIN5 -pGBDU -C3的SC-Ura/ 與SC-Ura/-Ade比較結果................49 圖二十二：CIN5-pGAD-C3 + pGBDU-C1-JHD1的SC-Ura/-Leu 與SC-Ura/-Leu /-Ade比較結果..........................................................................................................49 圖二十三：CIN5-pGAD-C3 + pGBDU-C1-JHD1的SC-Leu 與SC-Leu /-Ade 比較結果....................................................................................................................50 圖二十四：CIN5-pGAD-C3的SC-Leu 與SC-Leu /-Ade的比較結果...............50 圖二十五：Pro-NK (左)、NK (右)之PCR結果.....................................................80 圖二十六：insert：Pro-NK (左)、NK (右)與pGEM-T Easy Vector用限制酶確認之結果........................................................................................................................81 圖二十七：pro-NK、NK與pET-26b(+) vector用限制酶切下切位之結果 ..........81 圖二十八、二十九：pro-NK、NK 與pET-26 vector接合完後再用限制酶確認接合是否正確之結果....................................................................................................82 圖三十：( pro-NK)- His•Tag (左)、NK-His•Tag (右)之PCR結果.......................83 圖三十一：insert：(pro-NK)- His•Tag 、NK-His•Tag 與pGEM-T Easy Vector用限制酶確認之結果....................................................................................................84 圖三十二：(pro-NK)- His•Tag 、NK-His•Tag, pYES2 vector用限制酶切下切位之結果 ...........................................................................................................................85 圖三十三：(pro-NK)- His•Tag 、NK-His•Tag 與pYEST vector接合完後再用限制酶確認接合是否正確之結果................................................................................86 圖三十四：利用限制酶Sac I + EcoR I 切割確認質體轉型到表現宿主BJ2168後之 產物結果.....................................................................................................................87 圖三十五、三十六、三十七： pro-NK、NK的蛋白質表現誘導結果................88 圖三十八： pro-NK 蛋白質表現之生長曲線…………………………………....89 圖三十九： NK蛋白質表現之生長曲線………………………………………....89 圖四十、四十一：pro-NK、NK進行純化後之SDS-PAGE電泳圖 (上層液) …..90 圖四十二、四十三：pro-NK、NK進行純化後之SDS-PAGE電泳圖 (下層液) …91 表一、JHD1之PCR反應表........................................................................................7 表二、PCR的反應溫度與設定.....................................................................................7 表三、配製補adenine residue之反應溶液.................................................................10 表四、與TA- cloning接合反應溶液.........................................................................11 表五、用限制酶處理確認 plasmid DNA（pGEM-T-JHD1）之反應條件..........14 表六、BamH I限制酶切割(切第一刀)，反應條件..................................................15 表七、SalⅠ限制酶切割(切第二刀)，反應條件......................................................15 表八、選殖基因JHD1與表現載體pGBDU-C1之接合反應溶液..........................16 表九、BamH I限制酶切割(切第一刀)，反應條件....................................................17 表十、SalⅠ限制酶切割(切第二刀)，反應條件.......................................................18 表十一、PCR 複製雙股的基因片段，反應溶液.....................................................19 表十二、PCR的反應溫度..........................................................................................19 表十三、台大醫學院定序反應溶液...........................................................................20 表十四、利用限制酶處理（digestion）確認質體DNA反應條件..........................28 表十五、台大醫學院定序反應溶液..........................................................................29 表十六、BamH I限制酶切割(切第一刀)，反應條件...............................................30 表十七、SalⅠ限制酶切割(切第二刀)，反應條件..................................................31 表十八、選殖基因CIN5, JHD1與表現載體pGBDU-C3,pGAD-C1之接合反應溶液.................................................................................................................................31 表十九、BamH I限制酶切割(切第一刀)，反應條件............................................33 表二十、SalⅠ限制酶切割(切第二刀)，反應條件................................................33 表二十一、電破轉型達到之效率............................................................................39 表二十二、電破轉型長出顆數……………………………………………..……40 表二十三、 JHD1、CIN5、BD、AD在不同培養基的生長情形.......................51 表二十四、pro-NK與NK的PCR 複製雙股的基因片段，反應溶液...................58 表二十五、pro-NK與NK的PCR的反應溫度.........................................................58 表二十六、配製補adenine residue之反應溶液......................................................59 表二十七、用限制酶處理確認 plasmid DNA（pro-NK、NK）反應條件.......61 表二十八、台大醫學院定序反應溶液.....................................................................61 表二十九、BamH I限制酶切割(切第一刀)，反應條件........................................ 62 表三十、利用Xho І限制酶切割(切第二刀)，反應條件..........................................62 表三十一、選殖基因pro-NK、NK與表現載體pET-26b(+)之接合反應溶液…63 表三十二、利用BamH I限制酶切割(切第一刀)，反應條件.................................64 表三十三、利用Xho I限制酶切割(切第二刀)，反應條件……………………..64 表三十四、( pro-NK)- His•Tag與NK-His•Tag以PCR複製雙股的基因片段，反應溶液................................................................................................................................67 表三十五、( pro-NK)- His•Tag與NK-His•Tag PCR的反應溫度...........................67 表三十六、配製補adenine residue之反應溶液.......................................................68 表三十七、用限制酶處理確認 plasmid DNA（(pro-NK)- His•Tag、NK-His•Tag）反應條件....................................................................................................................70 表三十八、台大醫學院定序反應溶液....................................................................71 表三十九、利用Sac I限制酶切割(切第一刀)，反應條件......................................71 表四十、利用EcoR I限制酶切割(切第二刀)，反應條件.......................................72 表四十一、選殖基因(pro-NK)- His•Tag、NK-His•Tag與表現載體pYES2之接合反應溶液……………………………………………………………………………72 表四十二、利用Sac I限制酶切割(切第一刀)，反應條件......................................73 表四十三、利用EcoR I限制酶切割(切第二刀)，反應條件…………………....74 表四十四、配製12.5%分離凝膠（Separating gel）…………………………..…77 表四十五、配製3.7%焦集凝膠（Stacking gel）………………………………...77[[note]]學號: 695180769, 學年度: 9