Producción de células fúngicas y su aislamiento utilizando polielectrolitos

La enzima celulasa tiene una vasta aplicación industrial para la producción de biocombustibles, en la industria del papel, del detergente y textil. Los tres componentes que conforman el complejo enzimático (endoglucanasa, exoglucanasa y β-glucosidasa) pueden efectivamente degradar la celulosa. La fermentación en estado sólido (FES) llevada a cabo por hongos es una ruta de producción interesante debido a su bajo costo entre otras ventajas. En este trabajo se realizó la producción de celulasa por Aspergillus niger y Trichoderma harzianum por fermentación en estado sólido utilizando papel de desecho, marlo de maíz, cáscaras de soja, pellet de cáscaras de soja y residuos de la cosecha de soja, como soportes, y medio Mandels, en una proporción adecuada para alcanzar el porcentaje de humedad óptimo del sistema. El efecto del soporte sobre la producción de celulasa fue ensayado bajo un diseño factorial completamente aleatorizado. La interacción de los factores soporte-tiempo fue significativa para todas las variables estudiadas. Los soportes fueron caracterizados en términos de absorción de agua y punto de humedad crítico. Las muestras de cultivo fueron analizadas con Microscopía Electrónica de Barrido para visualizar la presencia de esporas y el crecimiento fúngico. La máxima actividad endoglucanasa fue encontrada a las 96 h utilizando cáscaras de soja como soporte (5914 U L-1). La actividad exoglucanasa fue máxima a las 96 h (4551 U L-1), siendo nueve veces mayor que la obtenida en papel residual al mismo tiempo de fermentación. La máxima actividad β-glucosidasa fue obtenida en cáscaras de soja alcanzándose un valor de 984 U L-1 a las 96 h. Además el uso de cáscaras de soja produjo altas productividades volumétricas a cortos tiempos de fermentación, y este hecho disminuye los costos de producción considerando un escalado del proceso. La velocidad de crecimiento radial (Vr) se evalúo en tres cepas de hongos: Trichoderma harzianum T104, Aspergillus niger GH1, Aspergillus niger NRRL3. Debido a que los datos de crecimiento radial han sido recolectados a través del tiempo, se llevó adelante un análisis estadístico longitudinal a través de un modelo mixto de medidas repetidas, mediante el software estadístico R. Según el análisis de la estructura de correlación de las medidas de crecimiento de las cepas en el tiempo, se determinó que la mejor alternativa para modelar los datos es la estructura autorregresiva. El modelo de medidas repetidas considerado, reveló que existe relación entre el tipo de cepa y el tiempo de crecimiento (p<0,0001) para al menos una de las cepas. Evaluando luego los contrastes de a pares de los medidas de crecimiento para cada cepa, se encontró que no existen diferencias estadísticamente significativas en cuanto al crecimiento en el tiempo de las cepas A. niger NRRL3 y A. niger GH1. A. niger GH1 y A. niger NRRL3 presentaron valores de Vr superiores a T. harzianum T104, siendo cuatro y cinco veces mayor respectivamente. Se evaluó el efecto del tiempo en la producción de celulasa para el soporte cáscaras de soja bajo un diseño completamente aleatorizado mediante un ANOVA unifactorial para cada una de las variables estudiadas (biomasa, actividad enzimática, proteínas totales, actividad específica, productividad volumétrica, productividad específica). Se observaron diferencias estadísticamente significativas para todas las variables estudiadas en los distintos tiempos ensayados. Las imágenes de Microscopía Electrónica de Barrido exhibieron una superficie rugosa de las cáscaras de soja. Se visualizó crecimiento fúngico sobre el soporte. Pudieron observarse hifas, esporas y conidióforos. Las esporas presentaron un rango de 2-3 μm de diámetro. En el presente trabajo se determinaron la temperatura óptima de actividad endoglucanasa y condiciones de estabilidad frente a pH y temperatura de un liofilizado comercial de la enzima. La temperatura óptima de la enzima endoglucanasa fue de 50°C y se observó que la endoglucanasa presentó un rango de temperatura de estabilidad entre 30ºC y 50ºC. Luego de 2 h de incubación la enzima disminuyó su actividad a un pH de 3,00. Por otra parte, se estudió la estructura secundaria de la engoglucanasa de Megazyme (EG) a diferentes valores de pH. Se observó una mayor disminución del contenido de estructura secundaria a pH 5,30 y 6,00 respecto de los otros pH estudiados. Además, se estudió la extinción de la fluorescencia de endoglucanasa nativa (EG) a diferentes valores de pH utilizando acrilamida como quencher. A pH 3,00 disminuyó la accesibilidad o afinidad del quencher por la enzima, disminuyendo su capacidad de interaccionar con dominios proteicos de la misma. En el presente trabajo se abordó el desarrollo de un método de aislamiento y purificación de la enzima producida por Aspergillus niger utilizando polímeros de cadena flexible: uno de ellos, sintético y aniónico, polivinil sulfonato de sodio (PVS); el otro natural y catiónico, chitosan (CHS). Además se estudiaron las mejores condiciones en las cuales ciertos polímeros de cadena flexible producen complejos insolubles con proteínas a través de mediciones de turbidez del medio (absorbancia a 420 nm). Se analizaron los efectos de la concentración de polímero, concentración de enzima, pH y fuerza iónica del medio, sobre la formación del complejo polímero-endoglucanasa. Se encontraron las relaciones óptimas de masas polímero/endoglucanasa comercial del complejo, y su rango de solubilidad. Se analizó, además, la forma de redisolución del mismo y la posibilidad de solubilizar a la proteína aislada de las impurezas presentes en su fuente natural. Luego de aplicado el método de precipitación se evaluó el estado funcional de la proteína en el precipitado y en el sobrenadante a través de medidas de actividad enzimática. También se analizaron el rendimiento y el factor de purificación. Los resultados obtenidos permitieron diseñar un método de aislamiento y purificación de celulasa utilizando precipitación por formación de complejos insolubles sobre un extracto enzimático obtenido a partir del cultivo de A. niger en medio sólido, utilizando como fuente de carbono y como soporte de crecimiento desechos agroindustriales. Se sintetizaron diferentes matrices poliméricas esféricas: esferas de CHS 2,5% P/V en HAc 5% V/V, matriz triturada de CHS 3% P/V en HAc 1% V/V, esferas de CHS entrecruzadas con epiclorhidrina,, esferas de CHS 2% P/V en HAc 5% V/V, CHS 2% P/V entrecruzada con Glutaraldehído 0,5% P/V, esferas de CHS - Eudragit® EPO, esferas de Alginato – Goma Arábiga. Se realizó la caracterización de las mismas mediante microscopía electrónica de barrido, espectrometría infrarroja con Transformada de Fourier (FTIR) utilizando Reflectancia Total Atenuada (ATR) de las matrices y titulación potenciométrica. Se realizaron estudios cinética de adsorción sobre las matrices obtenidas. Se llevó a cabo un estudio de adsorción endoglucanasa de origen fúngico sobre diferentes matrices para evaluar las variables factor de purificación y rendimiento. Según los resultados obtenidos, utilizando la matriz esférica de CHS 2% P/V entrecruzada con Glutaraldehído 0,5% P/V produjo los mayores valores de purificación y rendimiento para la adsorción de endoglucanasa de un cultivo fúngico. Se realizó un análisis ANOVA Bifactorial (matriz, tiempo) para la variable purificación y rendimiento del proceso de adsorción de la enzima endoglucanasa de origen fúngico con las matrices utilizadas. La interacción matriz-tiempo resultó significativa (p