Identificación y caracterización de compuestos antibacterianos a partir de productos naturales o semisintéticos

El sistema de dos componentes PhoP/PhoQ regula numerosos fenotipos de virulencia en Salmonella enterica. La proteína sensora PhoQ alterna entre un estado quinasa y fosfatasa en respuesta a la disponibilidad de Mg2+ en el medio, lo cual define el nivel de fosforilación del regulador de respuesta PhoP, modulando su actividad transcripcional. Este sistema constituye un objetivo estratégico para la búsqueda y desarrollo de compuestos que modulen específicamente su acción, destinados a la prevención y tratamiento de las patologías a las que Salmonella da origen. En este sentido, durante el trabajo de tesis de la Dra. Mariela Sciara se identificó que un extracto metanólico de Lamium amplexicaule era capaz de inhibir específicamente la expresión de genes regulados por el TCS PhoP/PhoQ, y se determinó que las especies responsables de este efecto eran los ácidos grasos insaturados de cadena larga presentes en la muestra. Mediante el uso de AG libres puros de origen comercial, se verificó que LCUFAs reprimían de manera dosis dependiente la expresión de genes regulados por PhoP, pero no afectaban la expresión de genes regulados por otros sistemas de dos componentes en el rango de concentraciones ensayadas. Además, los ácidos grasos saturados no mostraron efecto sobre ninguno de los genes reporteros, indicando especificidad de sustrato y de blanco de acción por parte de los LCUFAs sobre el sistema PhoP/PhoQ. Durante el presente trabajo de tesis, se estableció que, al ser agregados exógenamente al medio de cultivo bacteriano, los LCUFAs inhiben específicamente la capacidad de autofosforilación de la proteína sensora PhoQ en el mecanismo de transducción de la señal, lo que lleva a una disminución en los niveles de PhoP fosforilado y, finalmente, a una represión en la expresión de los genes del regulón phoPQ. Los ácidos grasos son metabolizados por la vía de β-oxidación, pero la integridad de esta ruta metabólica no es necesaria para observar la represión sobre el sistema de dos componentes PhoP/PhoQ, permitiendo concluir que los LCUFAs son las especies responsables de este efecto, y no los productos intermedios o el producto final de esta vía. Por otra parte, también se observó que la expresión de genes regulados por PhoP cuando el ácido graso insaturado era removido del medio de cultivo eran equiparables a los niveles de expresión en ausencia de compuesto, lo que lleva a concluir que el efecto de LCUFAs sobre el TCS es de naturaleza reversible. Además, se determinó que la presencia en simultáneo de dos ácidos grasos insaturados en el medio de crecimiento ejerce un efecto represor que es mayor que el de cada uno cuando se encuentra presente de manera individual. Por último, se ensayaron muestras de bilis fresca de rata que fueron agregadas al medio de cultivo LB, y que también mostraron inhibir de manera específica y dosis-dependiente la expresión del gen reportero regulado por PhoP sin afectar la actividad transcripcional del gen reportero control. Esto nos permite especular que existen compuestos en este fluido que podrían constituir señales fisiológicas para que Salmonella pueda coordinar la expresión de fenotipos de virulencia a través de la regulación de la actividad del sistema de dos componentes PhoP/PhoQ. Dado que no fue posible realizar un análisis más detallado de los componentes presentes en la muestra de bilis fresca, no podemos asegurar que el efecto inhibitorio sea debido a LCUFAs, cationes divalentes o una combinatoria de ambos presente en la muestra, o a otros compuestos que no han sido determinados hasta el momento. Estos resultados permiten concluir que los LCUFAs, sin mediar procesos metabólicos en la célula, actuarían como señales que inhiben la actividad de autofosforilación de la proteína sensora PhoQ, ya sea como ligandos interactuando directamente con la misma, o a través de la modificación de propiedades de la membrana interna bacteriana en la cual se encuentra inserta y que afecten la actividad catalítica de la misma. El hecho de que los ácidos grasos insaturados puedan ser señales que permitan a Salmonella distinguir los diferentes ambientes en los que se encuentra, y de esta manera, en conjunto con otros estímulos, coordinar los procesos para una exitosa invasión del hospedador, nos llevo a estudiar el patrón de expresión génica de cepas de Salmonella Typhimurium crecidas en presencia de C18:2 mediante ensayos de microarreglos. A partir del análisis del conjunto de datos, pudimos identificar varios genes involucrados en un mismo proceso metabólico o celular cuya expresión se encontraba reprimida en presencia de C18:2 en el medio de cultivo de una manera dependiente de PhoP. Tomando algunos de ellos, se realizó un análisis bioinformático que llevó a la identificación de cajas putativas de unión a PhoP sobre genes involucrados en el metabolismo de arginina, glutamato y aspartato, en el metabolismo de poliaminas, y en el mecanismo de sensado de la densidad poblacional (quorum-sensing). Al momento de escritura de este trabajo de tesis, se comenzó con la caracterización del efecto de la mutación en el regulador de respuesta PhoP sobre la actividad transcripcional y sobre los niveles de expresión proteica del gen speB (que codifica para una de las enzimas del metabolismo de espermidina) y del operon lsr (que codifica para el transportador responsable del quorum-sensing bacteriano). Finalmente, se ha notado en ensayos de Western-blot que muestras de células de S. Typhimurium crecidas en presencia de C18:2 que han sido inmunodetectadas con anticuerpos anti-PhoQ presentan bandas adicionales (PhoQ(+) “modificada”) a las observadas en muestras provenientes de células crecidas en medio control (PhoQ(-)), y que las mismas migran a un peso molecular aparente mayor que el correspondiente a la especie “sin modificar” de PhoQ. Se logró expresar en forma heteróloga en Escherichia coli, solubilizar y purificar la proteína recombinante His-PhoQ, tanto a partir de células crecidas en medio de cultivo control como con agregado de C18:2. En esta última condición también se evidenció la presencia de bandas adicionales, a pesar de estar trabajando en otro entorno génico al momento de expresar la proteína. Las fracciones resultantes de la purificación tuvieron una resolución electroforética que permitió escindir las bandas de manera individual para su análisis por espectrometría de masa (MS). Los estudios por MS arrojaron, en conjunto, una cobertura de secuencia de 72% y 60% para las proteínas His-PhoQ “nativa” y His-PhoQ “modificada”, pero no se pudieron identificar péptidos cuya masa detectada fuera diferente a la predicha y que pudiera deberse a la presencia de modificaciones post-traduccionales (PTMs). Tampoco se encontraron péptidos correspondientes a proteínas que posean un peso molecular similar al observado en el desplazamiento electroforético en la especie “modificada”. En base a estos y otros resultados, provenientes de tratamiento con agentes reductores, o de separación de las muestras en PAGE-SDS en presencia de urea 6M, favorecemos la hipótesis de que se trata de una PTMs que ocurre sobre la estructura del sensor PhoQ. Por otro lado, mediante el análisis del perfil de inmunodetección de muestras de cepas expresando la proteína quimérica ZhoQ crecidas en C18:2, se logró acotar la región en la proteína PhoQ donde se localizaría la modificación al extremo C-terminal citoplásmico de la misma. Más aún, por comparación entre versiones truncadas de PhoQ, observamos que el anclaje a la membrana de este dominio citoplásmico es condición necesaria para que la PTMs se produzca. Por último, se ha comenzado la caracterización del efecto de nuevos compuestos obtenidos a partir de extractos naturales sobre el sistema de dos componentes PhoP/PhoQ, pero los resultados son muy preliminares por lo que no han sido incluidos en este trabajo de tesis.Fil: Viarengo, Gastón. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET); Argentina