Das Aggresom als molekulare Zielstruktur präventiver Wirkungen des Polyphenols Quercetin im Rahmen Glucose-induzierter Schädigungen im Nematoden Caenorhabditis elegans

Weltweit nimmt die durchschnittliche Lebenserwartung und damit auch die Häufigkeit von altersbedingten Gesundheitsstörungen wie Diabetes mellitus Typ 2 zu. Diabetische Spätfolgen sind dabei die Konsequenz längerfristiger Hyperglykämien. Neben der akkuraten Kontrolle des Blutzuckers bzw. der konventionellen Therapie sind auch adjuvante Behandlungsmöglichkeiten, wie die Applikation sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe, zu denen die Polyphenole zählen, von besonderem Interesse. Zur Gruppe der Polyphenole gehört auch das am besten untersuchte Flavonol Quercetin aus Äpfeln und Zwiebeln. Studien am Modellorganismus Caenorhabditis elegans (C. elegans) zeigten bereits, dass die Inkubation mit Glucose die Lebensspanne der Nematoden verkürzt. Als einer der hierfür verantwortlichen Mechanismen wurde in der mev-1-Mutante, die durch erhöhte Konzentrationen von reaktiven Sauerstoffkonzentrationen (ROS) in den Mitochondrien gekennzeichnet ist, die Senkung der Aktivität des Proteasoms identifiziert. Durch zusätzliche Behandlung mit Quercetin konnte sowohl die Proteasomaktivität als auch die Überlebenszeit unter Hitzestress wieder auf den Wert der Kontrolle zurückgeführt werden, was mit einer Hemmung der Glucosetoxizität einhergeht. So war das Ziel der vorliegenden Arbeit die Bedeutung des Aggresoms als potentielle Zielstruktur von Quercetin im Rahmen der Glucose-induzierten Schädigungen in der mev-1-Mutante zu erforschen. Bei dem sogenannten Aggresom handelt es sich um ein Einschlusskörperchen, das bei einer Überlastung oder Störung des Ubiquitin-Proteasom-Systems aus aggregierten Proteinen zusammengesetzt wird, um deren toxischen Einfluss auf die Zellfunktionen zunächst durch Speicherung und schließlich durch Elimination via Autophagie zu verhindern. An der Bildung von Aggresomen sind verschiedene Adaptorproteine wie ubql-1 oder sqst-1 beteiligt, welche die polyubiquitinierten Proteine mithilfe des Dyneinmotorkomplexes, dessen wichtiger Bestandteil dnc-1 ist, zunächst entlang der Mikrotubuli in die Nähe des Zellkerns transportieren. Nach dem mittels RNA-Interferenz (RNAi) erzielten Knockdown der Aggresom-relevanten Gene ubql-1 bzw. dnc-1 kam es zu einer Erhöhung der Proteinaggregation und einer Verkürzung der Überlebenszeit unter Hitzestress bei 37 °C. Unter RNAi der beiden Gene führte Glucose nicht zu einer weiteren Verkürzung der Überlebenszeit, wobei Quercetin diese unter Glucoseexposition auch nicht mehr verlängern konnte. Dies weist darauf hin, dass Glucose durch Hemmung und Quercetin durch Aktivierung dieser Aggresom-relevanten Gene die Stressresistenz und die Überlebenszeit von mev-1 gegenteilig beeinflussen. Der Knockdown von sqst-1 hingegen hatte trotz der Verringerung der Autophagie keinen Effekt auf die Überlebenszeit der Nematoden, die Verkürzung der Überlebenszeit durch Glucose oder die Verlängerung der Überlebenszeit durch Quercetin in Gegenwart von Glucose. Demnach wurde sqst-1 im Gegensatz zu ubql-1 und dnc-1 nicht als Zielgen von Glucose und Quercetin ermittelt. Aufgrund des Anstiegs der Proteasomaktivität unter sqst-1 RNAi konnte das Proteasom als kompensatorischer Mechanismus für die reduzierte Aggresombildung identifiziert werden. Da die Mitochondrien unter hyperglykämischen Bedingungen durch die vermehrte ROS-Produktion an diabetischen Spätfolgen beteiligt sind, wurde noch die spezifische Elimination dieser Organellen durch die Mitophagie untersucht. Unter RNAi von Mitophagie-relevanten Genen (dct-1, drp-1, eat-3, fis-1, fzo1, glb-1, pink-1 und pgam-5) kam es nicht nur zu einer Verkürzung der Überlebenszeit von mev-1 bei 37 °C, sondern auch zur Verringerung der Proteasomaktivität, der Autophagie und der Bildung von Lysosomen, wohingegen die mitochondrialen ROS-Spiegel und die Proteinaggregation zunahmen. Nur in funktioneller Abwesenheit von PDR-1 blieben trotz des Anstiegs der ROS-Konzentration die Überlebenszeit der Nematoden, die spezifische Aktivität des Proteasoms sowie die Proteinaggregation im Vergleich zur Kontrolle unverändert. Dies liegt offenbar an der kompensatorischen Induktion der Mitophagie im Falle des Knockdowns von pdr-1. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Zunahme der Proteinaggregation durch die Störung der Bestandteile des Proteostase-Netzwerkes die Überlebenszeit von C. elegans unter Stressbedingungen beim Fehlen von Kompensationsmechanismen beeinträchtigt. Diese fanden nur in funktioneller Abwesenheit von sqst-1 und pdr-1 statt. Somit besitzt neben der Degradation der Mitochondrien über Autophagosomen auch die Elimination von geschädigten Proteinen über die Aggresomen eine wesentliche Bedeutung für die Lebensspanne der Nematoden. Hierbei konnten in der mev-1-Mutante ubql-1 und dnc-1 als Aggresom-relevante Zielgene von Quercetin in Bezug auf die Verlängerung der Lebensspanne unter glucotoxischen Bedingungen identifiziert werden.Along with the globally increasing life expectancy the frequency of age-related health problems like type 2 diabetes mellitus increases as well. Complications of diabetes are a consequence of longer-term hyperglycemia. Apart from an accurate blood sugar control or conventional therapy there is also an interest in adjuvant treatment options like the application of secondary plant products which include polyphenols. The best studied flavonol quercetin from apples and onions belongs to the polyphenols, too. Research studies using the model organism Caenorhabditis elegans (C. elegans) already showed that incubation with glucose decreases survival of the nematodes. One of the responsible mechanisms is the reduction of proteasomal activity in the mev-1 mutant, which is characterized by increased concentrations of reactive oxygen species (ROS) in mitochondria. By the additional treatment with quercetin proteasome activity as well as survival under heat stress was on the control level again indicating an inhibition of glucotoxicity. So, the aim of the current thesis was the examination of the meaning of the aggresom as a molecular target for the preventive effects of the polyphenol quercetin regarding the glucose-induced damage in the mev-1 mutant. The so-called aggresomes are inclusion bodies composed of aggregated proteins when the ubiquitin-proteasome-system is overloaded or impaired to inhibit their toxic effects on cell function by storage and elimination via autophagy. Different adaptor proteins like ubql-1 or sqst-1 are involved in the formation of aggresomes by binding polyubiquitinated proteins and transporting them with the dynein motor complex, containing the important component dnc-1, initially along the microtubules to the vicinity of the nucleus. After the knockdown of aggresome-related genes ubql-1 and dnc-1 by RNA interference (RNAi), protein aggregation increased and survival measured under heat stress at 37 °C was decreased. Under RNAi versus both genes, glucose did not lead to a further reduction of survival, whereas quercetin could not prolong it under glucose exposition. This shows that glucose-induced inhibition and quercetin-induced activation of aggresome-related genes influence the stress resistence and survival of mev-1 conversely. However, despite the reduction of autophagy, knockdown of sqst-1 had no effects on the survival of the nematodes, on the survival reduction by glucose or the survival prolongation by quercetin in the presence of glucose. So, in opposite to ubql-1 and dnc-1, sqst-1 was not detected as a target gene of glucose and quercetin. Because of the increase of proteasome activity under RNAi versus sqst-1 the proteasome could be identified as a compensatory mechanism against the reduced aggresome formation. As mitochondria are involved in diabetic complications through the increased ROS production under hyperglycemic conditions, the specific elimination of these organelles via mitophagy was also examined. Under RNAi versus mitophagy-related genes (dct-1, drp-1, eat-3, fis-1, fzo1, glb-1, pink-1 und pgam-5) survival of mev-1 at 37 °C, proteasome activity, autophagy as well as the formation of lysosomes were reduced, whereas the mitochondrial ROS levels and protein aggregation were increased. Only in functional absence of PDR-1, survival of the nematodes, proteasome activity and protein aggregation were not influenced compared to the control group despite the increased ROS concentration. This is apparently achieved by the compensatory induction of mitophagy after knockdown of pdr-1. In summary, it can be established that the increase of the protein aggregation by the disturbance of members of the proteostasis-network without compensatory mechanisms impairs survival of C. elegans under heat stress conditions. These mechanisms occured solely in functional absence of sqst-1 and pdr-1. Therefore, besides the degradation of mitochondria via autophagosomes also the elimination of damaged proteins through aggresomes is important for survival of the nematodes. Here, ubql-1 and dnc-1 could be identified as aggresome-relevant molecular targets in the mev-1 mutant regarding the survival prolongation under glucotoxic conditions