Functional and molecular studies on the regulation of sperm fertilizing ability and egg activation

En mamíferos, la formación de un nuevo individuo diploide es el resultado de la fusión de dos células haploides mediante el proceso denominado “fertilización”. A su vez, la entrada del espermatozoide fertilizante gatilla en el ovocito la “activación ovocitaria”, que constituye una de las primeras etapas del desarrollo embrionario el cual culminará con la implantación uterina. El objetivo general de esta Tesis ha sido estudiar aspectos funcionales y moleculares asociados al proceso de fertilización y a la activación ovocitaria utilizando dos aproximaciones experimentales distintas. En primer lugar, nos centramos en el estudio de moduladores moleculares de la activación ovocitaria y, en particular, de la translocación de fosfatidilserina (PS) en la membrana de ovocitos fertilizados de ratón y su relevancia para la activación del desarrollo. Los resultados mostraron que la exposición de PS no depende de la fusión de gametas, sino del aumento de calcio citoplasmático producido por el espermatozoide fertilizante o por la activación partenogenética. Observamos que la translocación de PS sólo ocurre luego de la entrada de calcio del medio extracelular y requiere la despolimerización de los filamentos de actina. Si bien este fenómeno no es consecuencia de la desorganización de la membrana producto de la exocitosis cortical, se evidenció que PS se expone mayoritariamente en los sitios de fusión de los gránulos corticales. En concordancia con este resultado, observamos por primera vez que luego de la exocitosis masiva de gránulos corticales se gatilla en el ovocito de ratón un mecanismo de endocitosis compensatoria y que este evento podría estar regulado por la exposición de PS. La segunda aproximación experimental se basó en el esclarecimiento del mecanismo de acción de un altamente efectivo anticonceptivo de emergencia, el acetato de ulipristal (UPA), más allá de su conocida acción antiovulatoria. Para ello, estudiamos si este regulador de la fertilidad presenta actividad inhibitoria sobre el proceso de fertilización y el desarrollo embrionario. Los resultados revelaron que UPA no altera la capacidad fertilizante del espermatozoide humano o murino ni el desarrollo del embrión de ratón. No obstante, la administración de UPA a hembras luego de ocurrida la fertilización y previa a la implantación previene la preñez debido a cambios en el endometrio que alteran su interacción con el embrión, develando un mecanismo adicional de este anticonceptivo que contribuiría a su alta efectividad. En conjunto, estos estudios proveen información novedosa asociada no sólo a los mecanismos de activación ovocitaria sino también a los mecanismos de acción de un anticonceptivo de emergencia ampliamente utilizado. Estos resultados podrían resultar fundamentales para el desarrollo de métodos de diagnóstico y tratamiento de la infertilidad, así como también para el apropiado uso de los métodos anticonceptivos existentes.In mammals, the formation of a new diploid individual is the result of the fusion of two haploid cells through the process called "fertilization". After fusion, the entry of the fertilizing sperm triggers in the egg a series of changes collectively referred to as "egg activation", one of the first steps of embryo development which will culminate with uterine implantation. The general objective of this Thesis has been to study functional and molecular aspects associated to the fertilization process and egg activation by employing two different experimental approaches. First, we focused on the study of molecular modulators of egg activation and, in particular, the translocation of phosphatidylserine (PS) in the membrane of fertilized mouse eggs and its relevance for activation of development. Results showed that the exposure of PS does not depend on gamete fusion itself, but on the increase of cytoplasmic calcium produced by the fertilizing sperm or by parthenogenetic activation. We observed that PS translocation only occurs after extracellular calcium influx and requires actin depolymerization. Although this phenomenon is not a consequence of the disorganization of the membrane produced by cortical exocytosis, we detected that external PS was mostly exposed in the fusion sites of the cortical granules. In accordance with this, we observed for the first time that fertilization as well as parthenogenetic activation triggers a compensatory endocytosis mechanism in mouse eggs after massive exocytosis of cortical granules, and that this event could be regulated by PS exposure. The second experimental approach focused on the elucidation of the mechanism of action of a highly effective emergency contraceptive, ulipristal acetate (UPA), beyond its well-known antiovulatory action. To do this, we studied whether this fertility regulator exerts inhibitory activity on the process of fertilization and embryo development. Results revealed that UPA does not alter the fertilizing ability of human or murine sperm or the mouse embryo development. However, administration of UPA to mouse females after fertilization and prior to implantation prevents pregnancy due to changes in the endometrium that alter its interaction with the embryo, revealing an additional mechanism of this contraceptive drug that would contribute to its high effectiveness. Altogether, these studies provide novel information associated not only with mechanisms of egg activation but also with mechanisms of action of a widely used emergency contraceptive. These results could be fundamental for the development of new methods of diagnosis and treatment of infertility, as well as for the appropriate use of existing contraceptive methodsFil: Gómez Elías, Matías Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentin