Contribución del co-transportador Na+- HCO3- y de la anhidrasa carbónica a las alteraciones por isquemia y reperfusión: rol de la mitocondria

Los cardiomiocitos poseen en la membrana diferentes transportadores iónicos encargados de regular el pH intracelular (pHi). Cuando el pHi es ácido existen dos mecanismos alcalinizantes responsables de dicha regulación: el intercambiador Na+/H+ (NHE) y el co-transportador Na+/HCO3- (NBC). Estudios previos describen la isoforma 1 de un NBC electrogénico (NBCe1) que en miocardio presenta una estequiometría 1 : 2 (Na+ : HCO3-) y que, además, posee dos bucles extracelulares con propiedades regulatorias (bucles 3 y 4). Experimentos realizados en miocitos aislados demuestran que el bloqueo del bucle 3 inhibe la actividad del NBCe1 y que el bloqueo del bucle 4 la aumenta.Las anhidrasas carbónicas (AC) son una familia de metaloenzimas que catalizan la hidratación reversible del dióxido de carbono (CO2) para producir ácido carbónico (H2CO3) que espontáneamente se hidroliza en HCO3- y H+. Resultados previos demuestran que las AC interaccionan con NHE y NBC formando lo que se conoce como metabolón de transporte iónico. De esta manera, las AC proveen de los iones necesarios para el funcionamiento de dichos transportadores, favoreciendo así la actividad de los mismos.Durante la isquemia-reperfusión (I/R) se producen cambios de pHi, que llevan a la activación de NHE y NBC, a la acumulación intracelular de Na+ y secundariamente a la de Ca2+, por activación del modo reverso del intercambiador Na+/Ca2+. La sobrecarga de Ca2+ es uno de los factores responsables de las alteraciones por I/R. Por lo tanto, las ¨intervenciones cardioprotectoras¨ han sido asociadas a una disminución de la concentración intracelular de este ion. Una de ellas es la llamada ¨reperfusión ácida (RA)¨. En la RA se perfunde al corazón con una solución de pH ácido, lo que reduce la actividad de los mecanismos alcalinizantes como consecuencia de la reducción del gradiente de H+ entre el citoplasma y el exterior celular. Esta menor actividad lleva a una menor sobrecarga de Na+ y por lo tanto, a una menor sobrecarga de Ca2+.El exceso de Ca2+ citosólico determina el aumento de la concentración de este ion en la mitocondria, que conduce a la formación y/o apertura de un poro de alta conductancia denominada poro de permeabilidad transitoria mitocondrial (PPTM). Este evento está ligado a las alteraciones mitocondriales por I/R y a la liberación de factores involucrados en la muerte celular.Distintos mediadores impactan sobre la membrana de los cardiomiocitos y producen la activación de cascadas de señalización que culminan en la mitocondria. Estas cascadas involucran a diferentes proteínas quinasas, entre ellas a las activadas por mitógenos (MAPK), perteneciendola p38 a una de sus subfamilias. Con respecto a esta proteína quinasa, existen estudios que muestran su papel cardioprotector, mientras que otros señalan su participación en la injuria generada por la I/R.Por todo lo expuesto, el objetivo general de este trabajo de tesis fue examinar la contribución del NBCe1 y de la AC a las alteraciones miocárdicas y mitocondriales producidas por I/R, analizando las vías de señalización involucradas. Específicamente, nuestro estudio se abocó a determinar los efectos de bloqueantes de NBCe1 y AC sobre el tamaño de infarto, la función miocárdica post-isquémica, la capacidad de retención de Ca2+ mitocondrial, la sensibilidad del PPTM al Ca2+ y el potencial de la membrana mitocondrial (Δψm). Otro de los objetivos de esta investigación fue analizar la participación de la p38MAPK en los efectos observados en las distintas intervenciones.Para cumplir con estos objetivos corazones aislados de rata Wistar de 4 a 5 meses de edad, perfundidos por el sistema de Langendorff, fueron sometidos a una isquemia global normotérmica de 30 minutos y luego reperfundidos durante 1 hora. Otros corazones fueron tratados durante los primeros 10 minutos de la reperfusión con un anticuerpo contra el bucle 3 del NBCe1 (a-L3) o con benzolamida (BZ, inhibidor de AC). En otro grupo experimental los corazones fueron tratados durante los 10 minutos previos a la isquemia y los primeros 10 minutos de la reperfusión con 6-etoxozolamida (ETX, inhibidor de AC). Para el protocolo de RA, los corazones fueron perfundidos durante los primeros 3 minutos de la reperfusión con una solución de pH = 6.4. En este grupo la reperfusión se completó hasta alcanzar los 60 min con la solución de pH = 7.4.La aplicación de 30 minutos de isquemia global y 60 minutos de reperfusión produjo un tamaño de infarto de aproximadamente 32 %. Este valor disminuyó significativamente con los tratamientos aplicados, llegando a aproximadamente 10, 6, 11 y 9 % en los grupos a-L3, BZ, ETX y RA, respectivamente.La función sistólica miocárdica disminuyó aproximadamente un 80 % al final del período de reperfusión. El tratamiento con a-L3, BZ, ETX y RA mejoró la recuperación post-isquémica del miocardio y los parámetros evaluados alcanzaron valores mayores a los obtenidos en el CI y S (62, 71, 62 y 55 % respectivamente vs. 20 %). La función diastólica también mejoró con todos los tratamientos. El aumento de la presión diastólica final observado durante la reperfusión fue significativamente menor en los corazones tratados con a-L3, BZ, ETX y RA.Las alteraciones mitocondriales detectadas en la reperfusión fueron significativamente atenuadas por los tratamientos. Así, la despolarización mitocondrial (Δψm aproximadamente -95mV) observada en el grupo no tratado fue revertida totalmente, adquiriendo en los grupos tratados con a-L3, BZ, ETX y RA valores aproximados a -140 mV, que fueron similares a los obtenidos en corazones no isquémicos. Las muestras mitocondriales procedentes de los corazones tratados también mostraron una recuperación de la capacidad de retención de Ca2+ y de la respuesta a dicho ion asociada a una menor apertura del PPTM.Con respecto a la p38MAPK, su expresión disminuyó a 41 % en los corazones sometidos a I/R pero aumentó significativamente en presencia de a-L3, BZ, ETX y RA, adquiriendo valores de alrededor de un 135 %. Con el objeto de determinar una posible vía de activación de p38MAPK y un posible blanco de dicha quinasa, evaluamos la expresión de calcineurina (fosfatasa dependiente de Ca2+) y la proteína de choque térmico 27 (en inglés Heat Shock Protein 27, HSP27) en todos los grupos experimentales. Nuestros datos muestran que la expresión de calcineurina aumentó mientras que la de HSP27 disminuyó en los corazones no tratados. El bloqueo del NBCe1, la inhibición de AC y la RA disminuyeron el contenido de calcineurina y aumentaron el de HSP27.Los datos de este trabajo de tesis también muestran que la administración de SB202190, inhibidor de p38MAPK, anula todos los efectos beneficiosos observados en los corazones tratados con a-L3, BZ, ETX y RA.Por lo tanto, los resultados obtenidos en este trabajo de tesis muestran que el bloqueo del bucle extracelular 3 del NBCe1 con a-L3, la inhibición de AC con BZ o ETX y la RA:1- Disminuyen el tamaño del infarto y aumentan la recuperación post-isquémica de la función sistólica y diastólica miocárdicas.2- Mejoran el estado mitocondrial, atenuando la despolarización y recuperando la capacidad de retención y de respuesta al Ca2+.3- Promueven una disminución de la expresión de calcineurina Aβ y un aumento del contenido de P-p38MAPK y P-HSP27.Estos datos indican que una reducción en la sobrecarga de Ca2+, consecuente a una actividad reducida de los mecanismos alcalinizantes, podría producir una menor activación de calcineurina y una activación de la vía p38MAPK-HSP27 que llevaría a la mejora mitocondrial, blanco final de la cardioprotección. Además, estos resultados sugieren que los tratamientos aquí ensayados podrían servir como posibles herramientas terapéuticas para atenuar los daños miocárdicos y mitocondriales producidos por la I/R.Cardiomyocytes have different ionic transporters in the membrane responsible for regulating intracellular pH (pHi). When the pHi is acid there are two alkalinizing mechanisms responsible for this regulation: the Na+ /H+ exchanger (NHE) and the Na+ /HCO3 - (NBC) cotransporter. Previous studies describe the isoform 1 of an electrogenic NBC (NBCe1) that in myocardium has a stoichiometry of 1 : 2 (Na+ : HCO3 - ) and possess two extracellular loops with regulatory properties (loops 3 and 4). Experiments performed in isolated myocytes demonstrate that the blockade of loop 3 inhibits the activity of NBCe1 and the inhibition of loop 4 increases it. Carbonic anhydrases (CA) are a family of metalloenzymes that catalyze the reversible hydration of carbon dioxide (CO2) to produce carbonic acid (H2CO3) that spontaneously hydrolyzes into HCO3 - and H+ . Previous results demonstrate that CA interacts with NHE and NBC forming ion transport metabolon. In this way, the CAs provide ions for the operation of these exchangers, thus improving their activity. During ischemia-reperfusion (I /R) there are changes in pHi, which lead to the activation of NHE and NBC, the accumulation of intracellular Na+ and secondarily that of Ca2+, by activation of the reverse mode of the Na+ /Ca2+ exchanger. The overload of Ca2+ is one of the factors responsible for the alterations by I/R. Therefore, "cardioprotective interventions" have been associated with a decrease in the intracellular concentration of this ion. One of them is the called "acid reperfusion (RA)". In RA, the heart is perfused with a solution of acid pH, that reduce the activity of alkaline mechanisms becouse of a reduction of the H+ gradient between the cytoplasm and the cell exterior. This lower activity leads to a lower overload of Na+ and, therefore, a lower Ca2+ overload. The excess of cytosolic Ca2+ determines the increase in the concentration of this ion in the mitochondria, which leads to the formation and/or opening of a high conductance pore called mitochondrial permeability transition pore (MPTP). This event is linked to mitochondrial alterations by I/R and the release of factors involved in cell death. Different mediators impacting on the cardiomyocyte membrane produce the activation of multiple signaling cascades that culminate on mitochondria. These cascades involve different protein kinases, including those activated by mitogens (MAPK), being p38 one of its subfamilies. With regard to this protein kinase, there are studies that show its cardioprotective role, while others indicate its participation in the injury generated by I/R. The general objective of this thesis work was to examine the participation of NBCe1 and CA to the myocardial and mitochondrial alterations produced by I/R, analyzing the involved signaling pathways. Specifically, our study aimed to determine the effects of NBCe1 and AC blockade on infarct size, post-ischemic myocardial function, mitochondrial Ca2+ retention capacity, MPTP sensitivity to Ca2+ and the mitochondrial membrane potential (Δψm). The analysis of the participation of p38MAPK in the observed effects was also other objective of our investigation. To achieve these objectives, isolated hearts from Wistar rats of 4 to 5 months old, perfused by the Langendorff system, were subjected to a normothermic global ischemia of 30 minutes and then reperfused for 1 hour. Other hearts were treated during the first 10 minutes of reperfusion with an antibody against loop 3 of NBCe1 (a-L3) or benzolamide (BZ, AC inhibitor). In another experimental group, the hearts were treated during the 10 minutes prior to ischemia and the first 10 minutes of reperfusion with 6-etoxyzolamide (ETX, AC inhibitor). For the RA protocol, hearts were perfused during the first 3 minutes of reperfusion with a solution of pH = 6.4. In this group, the reperfusion was completed until reaching 60 min with the solution of pH = 7.4. The application of 30 minutes of global ischemia and 60 minutes of reperfusion produced an infarct size of approximately 32 %. This value decreased significantly with the treatments, reaching approximately 10, 6, 11 and 9 % in a-L3, BZ, ETX and RA groups, respectively. The myocardial systolic function decreased approximately 80 % at the end of the reperfusion period. The treatment with a-L3, BZ, ETX and RA improved post-ischemic myocardial recovery reaching higher values than those observed in CI and S (62, 71, 62 and 55 % of the preischemic values, respectively vs. 20 %). The diastolic function was also improved with all treatments. The increase in end diastolic pressure observed during reperfusion was significantly decreased in hearts treated with a-L3, BZ, ETX and RA. The mitochondrial alterations detected in the reperfusion were significantly attenuated by the treatments. Thus, the mitochondrial depolarization (Δψm approximately -95 mV) observed in the untreated group was completely reversed, acquiring values of approximately -140 mV in hearts treated with a-L3, BZ, ETX and RA. This value was similar to that obtained in non-ischemic hearts. The mitochondrial samples from the treated hearts also showed a recovery of the Ca2+ retention capacity and the response to that ion associated to a less PPTM opening. Regarding p38MAPK, its expression decreased to 41 % in hearts subjected to I/R but increased significantly in the presence of a-L3, BZ, ETX and RA, acquiring values of around 135 %. In order to determine a possible activation pathway of p38MAPK and a possible target of it, we evaluated the expression of calcineurin (Ca2+ dependent phosphatase) and the heat shock protein 27 (HSP27) in all the experimental groups. Our data show that calcineurin expression increased while HSP27 decreased in untreated hearts. The blockade of NBCe1, the inhibition of AC and RA decreased the calcineurin and increased the HSP27 contents. Our data also show that the administration of SB202190, inhibitor of p38MAPK, abolished all the beneficial effects observed in hearts treated with a-L3, BZ, ETX and RA. Therefore, the results obtained in this thesis work show that the blockade of the extracellular loop 3 of NBCe1 with a-L3, the AC inhibition with BZ or ETX, and RA: 1- Reduce the infarct size and increase the recovery of the post-ischemic myocardial systolic and diastolic function. 2- Improve the mitochondrial state, attenuating depolarization and recovering the capacity of retention and response to Ca2+ . 3- Promote a decrease of calcineurin Aβ expression and an increase of P-p38MAPK and PHSP27 contents. These data indicate that a reduction of Ca2+ overload, consequent to a reduced activity of the alkalizing mechanisms, could be responsible for the less activation of calcineurin, activation of p38MAPK-HSP27 and improvement of mitochondrial state as the end target of cardioprotection. In addition, these results suggest that the treatments used here could serve as potential therapeutic tools to attenuate the myocardial and mitochondrial damage produced by I/R.Fil: Ciocci Pardo, Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigaciones Cardiovasculares "Dr. Horacio Eugenio Cingolani". Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Centro de Investigaciones Cardiovasculares "Dr. Horacio Eugenio Cingolani"; Argentin