Saccharomyces uvarum de ambientes naturales y bebidas fermentadas de la Norpatagonia: caracterización y potencial para elaborar sidras a bajas temperaturas

Las levaduras responsables de la transformación del mosto de manzana en sidra pertenecen al género Saccharomyces, y en general a la especie Saccharomyces cerevisiae. No obstante, aun cuando ésta es la especie más abundante, otras levaduras de este género como Saccharomyces uvarum también han sido descriptas en este proceso. S. uvarum presenta características únicas que incluyen un sistema activo de transporte de fructosa (azúcar mayoritario en el mosto de manzana), buena capacidad fermentativa y criotolerancia. Produce además menor cantidad de etanol y mayor de glicerol que S. cerevisiae, y un perfil de compuestos volátiles que influyen directamente en el aroma del producto como el alcohol superior 2-feniletanol y su respectivo éster de acetato.La gran diversidad de cepas de S. uvarum que coexisten en la Patagonia, tanto en ambientes naturales como en bebidas tradicionales, ofrecen un escenario ideal para estudiar de manera comparada las características fisiológicas y genotípicas de las distintas cepas y su potencial como cultivos iniciadores para la elaboración de sidras con características particulares y con impronta 100% patagónica. El objetivo de esta Tesis fue evidenciar la presencia de S. uvarum en sidras fermentadas a baja temperatura en la Norpatagonia y comparar fisiológica y genéticamente las cepas disponibles de esta especie obtenidas de diferentes ambientes a fin de conocer sus principales diferencias asociadas a su origen y su potencialidad para ser usadas como cultivos iniciadores en la producción de sidras con características organolépticas diferenciales. En el primer capítulo de esta Tesis se evaluó el comportamiento fermentativo y otras propiedades tecnológicas y fisiológicas de interés para la elaboración de sidras, de 21 cepas de S. uvarum aisladas de chicha de manzana y sustratos naturales de la Norpatagonia y 13 cepas de su especie hermana S. eubayanus aisladas de los mismos ambientes naturales. Se observó un comportamiento similar entre cepas de igual origen, es decir las sidras fermentadas con cepas aisladas de ambientes naturales de ambas especies (S. uvarum y S. eubayanus) presentaron características fisicoquímicas y cinéticas similares, diferenciándose de las fermentadas con cepas de S. uvarum aisladas de chichas. Se analizó posteriormente la producción de metabolitos secundarios asociados con el aroma de las sidras utilizando una cepa seleccionada de cada especie y origen. Nuevamente, los perfiles obtenidos con las cepas aisladas de ambientes naturales (S. uvarum NPCC1290 y S. eubayanus NPCC1292) fueron similares, destacándose ambas por producir altas concentraciones de 2-feniletanol, mientras que la cepa aislada de chicha (S. uvarum NPCC1314) produjo concentraciones más elevadas de ésteres en general. Se seleccionó la cepa S. uvarum NPCC1314 para realizar fermentaciones con mosto de manzana no estéril a escala semi-piloto, utilizando como comparación la cepa comercial S. cerevisiae BO213, usada para elaborar sidras en la región. Las fermentaciones se realizaron a 20°C y a 13°C obteniendo mayor implantación de S. uvarum (66% vs 100%, respectivamente) a 13ºC. La levadura comercial evaluada no se implantó en ninguna condición. El análisis sensorial mostró preferencia por la sidra fermentada con S. uvarum NPCC1314 a 20ºC y por S. cerevisiae BO213 a 13ºC. En paralelo, se realizó la búsqueda de nuevas cepas de S. uvarum en sidras, utilizando baja temperatura (13ºC) como agente selectivo. Se detectaron varias cepas de S. uvarum, sólo a 13ºC y en mosto Red Delicious. Este hallazgo representa el primer reporte de aislamiento de cepas de esta especie en un proceso fermentativo industrial en Argentina. Con estas nuevas cepas se realizó la misma caracterización fisiológica realizada previamente y se seleccionó la cepa de S. uvarum NPCC1420 para realizar fermentaciones a 13ºC, a escala semipiloto utilizando mostos manzana (variedades Granny Smith y Pink Lady) y pera (Packams/D´Anjou). Se utilizó con fines comparativos en este caso, la cepa de chicha S. uvarum NPCC1314. Los mayores porcentajes de implantación en esta oportunidad se obtuvieron con la cepa de sidra S. uvarum NPCC1420; y el análisis sensorial mostró preferencia por las sidras fermentadas con esta levadura solo en mosto de manzana Pink Lady, mientras que en mosto Granny Smith las sidras preferidas fueron las fermentadas con la levadura aislada de chicha. En el segundo capítulo de la Tesis se realizaron ensayos comparativos a nivel genético y fisiológico utilizando todas las cepas de S. uvarum aisladas en este trabajo (33) y además 28 cepas de la misma especie aisladas de diferentes países de Europa y sustratos. Utilizando datos de secuencia de siete genes nucleares el análisis de estructura poblacional evidenció por primera vez tres subpoblaciones en la Patagonia, hasta ahora sólo sugeridas pero no respaldadas por análisis poblacionales quizás por el bajo número de cepas de ambientes fermentativos disponibles hasta ahora: Sudamérica-A, Sudamérica-B y Holártica. La subpoblación Sudamérica-B, altamente diferenciada del resto y representada únicamente por cepas aisladas de ambientes naturales, comparte nicho con la subpoblación Sudamérica-A sin evidenciar flujo génico. Las cepas aisladas de sidra pertenecieron principalmente a la subpoblación Holártica y las de chicha resultaron una mezcla de Holárticas y Sudamérica-A. El análisis del gen mitocondrial COX2 si evidenció cierto flujo génico entre las dos subpoblaciones de ambientes naturales.A nivel fisiológico se evaluó la respuesta de todas las cepas a diferentes condiciones de estrés típicas del proceso de elaboración de sidras: crecimiento en diferentes temperaturas y crecimiento en diferentes concentraciones de etanol, de SO2 y de nitrógeno fácilmente asimilable. Se observó que las cepas europeas presentaron una mejor adaptación a temperaturas bajas (a 13°C) en relación a las patagónicas (independientemente del origen). Las cepas aisladas de ambientes naturales (patagónicas y europeas) presentaron muy baja resistencia al etanol. Asimismo, las cepas aisladas de ambientes fermentativos europeas mostraron un mayor requerimiento de nitrógeno que las de ambientes naturales. Por último, las cepas fermentativas europeas y las cepas de sidra de la Patagonia mostraron la mayor resistencia al SO2, mientras que las de ambientes naturales y chicha una muy baja resistencia. Se evidenció en las cepas resistentes una traslocación entre los cromosomas XVI y el VII (7 cepas europeas y 3 patagónicas, todas fermentativas) que involucra al gen del trasportador de sulfito SSU1 y en ensayos de expresión diferencial del gen SSU1 en condiciones de fermentación se observó un incremento en su expresión mayor a 10 veces en las cepas europeas con la traslocación respecto de las patagónicas en fermentaciones con y sin sulfito, pudiendo concluir que esta traslocación provoca la expresión constitutiva del gen, lo que le otorga una alta resistencia a las cepas que contienen la traslocación. Estos datos pusieron en evidencia diferencias fisiológicas entre cepas de S. uvarum que podrían relacionarse al proceso de elaboración de bebidas fermentadas. Las principales diferencias fisiológicas observadas no se asocian directamente con las relaciones filogenéticas existentes entre las cepas sino que más bien responden al ambiente de origen de las cepas en particular.Yeasts responsible for the transformation of apple must into cider belong to Saccharomyces genus and, in general, to Saccharomyces cerevisiae specie. Nevertheless, although this is the most abundant specie other yeasts belonging to this genus, like Saccharomyces uvarum, have been also described in this fermentations process. S. uvarum shows unique features that includes an active transport system of fructose (major sugar in apple must), good fermentative capacity and cryotolerance. It also produces lower amount of ethanol and higher glycerol than S. cerevisiae and volatile compounds profiles that affects in a direct way the aroma of the product, like the higher alcohol 2-phenylethanol and its respective acetate ester. The great diversity of S. uvarum strains that coexist in Patagonia, both in natural environment and in traditional beverages, offer an ideal scenario for studding, in a comparative way, physiological and genotypic features of the different strains and its potential as starter cultures for producing ciders with particular characteristics and with a 100% Patagonian imprint. The objective of this Thesis was to evidence the presence of S. uvarum in ciders fermented at low temperature in North Patagonia and to compare physiologically and genetically available strains of this specie obtained from different environment, in order to know its main differences associated to its origin and its potentiality for employ them as started cultures in the production of ciders with different organoleptic characteristics. In the first chapter of this Thesis the fermentative behaviour and other technologic and physiologic properties of interest for cider elaboration were evaluated, of 21 S. uvarum strains isolated from apple chicha and natural substrates from North Patagonia and 13 strains of its sister species S. eubayanus, isolated from the same natural environment. A similar behaviour between strains from the same origin was observed, ciders fermented with strains isolated from natural environment of both species (S. uvarum and S. eubayanus) showed similar physiologic and kinetic characteristics, differentiating from fermented with S. uvarum strains isolated from chichi. After that, secondary metabolites production associated with ciders aroma using a selected strain from each species and origin was evaluated. Again, profiles obtained with the strains isolated from natural environment (S. uvarum NPCC1290 and S. eubayanus NPCC1292) were similar, both producing high concentrations of 2- phenylethanol, while the strain isolated from chicha (S. uvarum NPCC1314) produced higher concentrations of general esters. S. uvarum NPCC1314 strain was selected for performing fermentations with no sterile apple must in semi-pilot scale, using S. cerevisiae BO213 strain in a comparative manner, employed for cider producing in the region. Fermentations were carried out at 20°C and 13°C, obtaining higher implantation of S. uvarum (66% vs 100%, respectively) at 13°C. Commercial yeast evaluated couldn´t dominate the fermentations in any condition. Sensorial analysis evidenced preference for cider fermented with S. uvarum NPCC1314 at 20°C and for S. cerevisiae BO1213 at 13°C. In the same way, new strains research of S. uvarum in ciders was carried out, employing low temperature (13°C) as a selective agent. Many S. uvarum strains were detected, only at 13°C in Red Delicious must. This finding represents the first isolation report of strains belonging to this species from industrial fermentative process in Argentina. These new strains were used for making the same physiologic characterization previously studied and S. uvarum NPCC1420 strain was selected for fermentations at 13°C at semi-pilot scale using apple must (Granny Smith and Pink Lady varietals) and pear (Packams/D´Anjou). S. uvarum NPCC1314 strain from chicha was used in a comparative way. In this case, the highest implantation percentages were obtained with the cider S. uvarum NPCC1420 strain and the sensorial analysis showed preference for ciders fermented with this yeast only in Pink Lady must, while in Granny Smith must preferred ciders were the ones fermented with the yeast isolated from chicha. In the second chapter of this Thesis, comparative assays at genetic and physiological levels were tested employing all the S. uvarum strains isolated in this work (33) and also 28 strains belonging to the same species isolated from different European countries and substrates. Using seven nuclear genes sequence data, the population structure analysis evidenced, for the first time, three subpopulations in Patagonia, only suggested but not supported by population analysis until now, possibly due to the low number of fermentative environment strains available up to now: South America-A, South America-B and Holartic. South America-B subpopulation, markedly different from the rest and represented only for strains isolated from natural environment, shares niche with the South America-A population without evidencing genic flow. The cider’s strains belonged mainly to the Holarctic subpopulation and the strains isolated from chicha were a mixture between the Holartic and South America-A subpopulation. In the analysis of the mitochondrial COX2 gene a certain gene flow between the two subpopulations of natural environments was observed. At the physiological level, the response of all the strains to different stress conditions typical of the cider production process was evaluated: growth at different temperatures and growth at different concentrations of ethanol, SO2 and yeast assimilable nitrogen. The European strains showed a better adaptation to low temperatures (at 13°C) in relation to the Patagonians strains (independently of the origin). Strains isolated from natural environments (Patagonia and Europe) showed a very low resistance to ethanol. Further, strains isolated from fermentative environments showed a higher nitrogen requirement than the strains from natural environments. Finally, the European fermentative strains and the cider strains of Patagonia showed the highest resistance to SO2, while those isolated from natural environments and chicha showed a very low resistance. A translocation between chromosomes XVI and VII (7 European and 3 Patagonian strains, all fermentative) was found, which involve the SSU1 sulphite transporter gene and in differential expression assays of the SSU1 gene under fermentation conditions, an increase in its expression greater than 10-fold was observed in the European strains with the translocation compared to the Patagonian ones in fermentations with and without sulphite, being able to conclude that this translocation causes the expression constitutive of the gene, which gives a high resistance to the strains that contain the translocation. These data revealed physiological differences between strains of S. uvarum that could be related to the process of industrial fermented beverages. The main physiological differences observed are not directly associated with the phylogenetic relationships existing between the strains but rather respond to the environment of origin of the strains in particular.Fil: Gonzalez Flores, Melisa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Patagonia Norte. Instituto de Investigación y Desarrollo en Ingeniería de Procesos, Biotecnología y Energías Alternativas. Universidad Nacional del Comahue. Instituto de Investigación y Desarrollo en Ingeniería de Procesos, Biotecnología y Energías Alternativas; Argentina. Universidad Nacional del Comahue. Centro Regional Universitario Bariloche; Argentin