Avaliação da produção e análise estrutural dos exopolissacarídeos obtidos de Herbaspirillum rubrisubalbicans cultivados em diferentes fontes de carbono

Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Vassoler SerratoDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências - Bioquímica. Defesa : Curitiba, 29/03/2019Inclui referências: p.51-58Resumo: A espécie Herbaspirillum rubrisubalbicans é uma bactéria diazotrófica e endofítica, possuindo a capacidade de fixar nitrogênio atmosférico contribuindo para a promoção do crescimento vegetal, associando-se principalmente a gramíneas tais como arroz, milho, trigo, sorgo e cana-de-açúcar, bananeira e abacaxizeiro. Com o intuito de se obter um melhor entendimento sobre a interação entre planta e micro-organismo, vários estudos envolvendo expressão gênica de procariotos e eucariotos são realizados constantemente, como também, relacionando constituintes da superfície bacteriana, como os exopolissacarídeos (EPS). Conhecendo a importância do EPS para a interação planta-bactéria, e sabendo que a caracterização dos EPS microbianos é importante na determinação da aplicabilidade desses biopolímeros, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a produção de EPS por nove estirpes de Herbaspirillum rubrisubalbicans em meio NFb-malato como também em fontes de carbono alternativas e determinar a estrutura dos EPS purificados, utilizando métodos químicos, espectrométricos e espectroscópicos. Para isto, as estirpes foram crescidas em meio NFb-malato sendo posteriormente realizadas as determinações de açúcares através do método de Dubois, e quantificação de proteínas através do método de Bradford. As estirpes M4, BA15 e BA16 se destacaram por obter a maior eficiência de transformação do malato em carboidrato. A cromatografia em camada delgada demonstrou glucose e galactose como componentes principais de todos os EPS analisados e também a presença de rhamnose na estirpe M1. Na composição monossacarídica, as amostras também apresentaram quantidades significativas de glucose e galactose exceto pela estirpe M1 que apresentou 4,7% de Gal e mostrou a presença de Xyl (24,2%) e Rha (28,9%) em quantidades muito superiores às demais estirpes analisadas. As nove estirpes também foram crescidas em diferentes fontes de carbono e obtiveram um perfil de rendimento heterogêneo, onde as estirpes que obtiveram a maior relação carboidrato:proteína foram BA11 e BA15 em citrato de sódio; M1 em frutose, glicerol e manitol; BA15 em galactose; BA149 e M4 em glucose e M4 e BA10 em malato. A estirpe M1 obteve a maior produção de EPS e por isso foi selecionada para o cultivo em grande escala. Foram realizados os cultivos em grande escala no meio glicerol, manitol e malato e, por cromatografia em camada delgada pôde ser visualizada banda dos monossacarídeos de glucose e galactose no meio contendo glicerol como fonte de carbono e a presença de manose no meio contendo manitol como fonte de carbono. A análise da composição monossacarídica corrobora os resultados e ainda ressalta a presença de fucose (14%) e galactose (7%) em glicerol e arabinose (2%), manose (67%) e Rha (17%) em manitol. Os dados PMAA da estirpe M1, apresentaram-se muito semelhantes, sendo os principais derivados observados 2,3,6-Me3-Glc, 2,3,4-Me3-Glc e 2,3-Me2-Glc em ambas as amostras. As amostras também se apresentaram semelhantes nas análises de RMN, com a exceção dos sinais atribuídos às unidades de Rha no EPS produzido no cultivo com manitol. Palavras-chave: Exopolissacarídeos. Herbaspirillum rubrisubalbicans. Interação Planta- Bactéria.Abstract: Herbaspirillum rubrisubalbicans is a diazotrophic and endophytic bacterium, which has the hability to fix atmospheric nitrogen by contributing to plant growth promotion, and are associated mainly with grasses such as rice, corn, wheat, sorghum and sugarcane, along with banana and pineapple. In order to obtain a better understanding of the interaction between plant and microorganism, several studies involving prokaryotes and eukaryotes gene expression are performed constantly, as well as relating bacterial surface constituents such as exopolysaccharides (EPS). Knowing the importance of EPS for plant-bacterial interaction, and having knowledge that the characterization of microbial EPS is important in determining the applicability of these biopolymers, the objective of this work was to evaluate EPS production of nine strains of Herbaspirillum rubrisubalbicans in NFb-malate medium, as well as on alternative carbon sources and determine the structure of the purified EPS using chemical, spectrometric and spectroscopic methods. For this, the strains were grown in NFb-malate medium and the sugar determinations were performed by Dubois method, and protein quantification by Bradford method. The strains M4, BA15 and BA16 stood out for obtaining the greatest efficiency of turning malate into carbohydrate. Thin-layer chromatography demonstrated glucose and galactose as major components of all EPS analyzed and also the presence of rhamnose in strain M1. In monosaccharide composition analysis, the samples also presented significant amounts of glucose and galactose except for M1 strain which presented 4.7% of Gal and showed the presence of Xyl (24.2%) and Rha (28.9%) in quantities much higher to other analyzed strains. The nine strains were also grown at different carbon sources and obtained a heterogeneous yield profile, where the strains that obtained the highest carbohydrate:protein ratio were BA11 and BA15 in sodium citrate; M1 in fructose, glycerol and mannitol; BA15 in galactose; BA149 and M4 on glucose and M4 and BA10 on malate. The M1 strain obtained the highest EPS production and therefore was selected for large-scale cultivation. Large-scale cultures were carried out in glycerol, mannitol and malate medium and, by thin-layer chromatography glucose and galactose monosaccharide bands could be visualized in the medium containing glycerol as the carbon source and also the presence of mannose in the medium containing mannitol as carbon source. Monosaccharide composition analysis corroborates the results and also emphasizes the presence of fucose (14%) and galactose (7%) in glycerol and arabinose (2%), mannose (67%) and rhamnose (17%) in mannitol. The PMAA data from strain M1 were very similar, with the main derivatives being 2,3,6-Me3-Glc, 2,3,4-Me3-Glc and 2,3-Me2-Glc in both samples. The samples were also similar in the NMR analyzes, with the exception of the signals assigned to the rhamnose units in EPS produced in the culture with mannitol. Keywords: Exopolysaccharides. Herbaspirillum rubrisubalbicans. Plant-bacterial interaction