Evolução in vitro e seleção de variantes Cry para o controle da broca-gigante da cana-de-açúcar.

A cultura da cana-de-açúcar desde sempre reteve destacada relevância para a economia brasileira decorrente dos produtos que gera e pela demanda premente da utilização de biocombustíveis renováveis na matriz energética atual. Todavia, inúmeras doenças e pragas persistem e precisam ser continuamente estudadas de forma a se obter variedades geneticamente melhoradas e resistentes. O potencial biotecnológico das d-endotoxinas produzidas em inclusões cristalinas provenientes de bactérias formadoras de esporos, a exemplo do Bacillus thuringiensis, é amplamente estabelecido. Nesta assertiva, buscou-se construir uma biblioteca de variantes do gene cry1Ia12synth e selecionar variantes codificadoras de toxina Cry1Ia12synth com atividade entomotóxica diferenciada contra larvas de broca gigante (Telchin licus licus) da cana-de-açúcar, por meio da estratégia de utilização combinada das técnicas de DNA shuffling (evolução molecular in vitro) e Phage display (apresentação em superfície de fagos). Novas toxinas foram selecionadas por varredura de moléculas afins das proteínas presentes nas vesículas de membrana do intestino médio de larvas de T.l.licus. Centenas de variantes foram analisadas e 30 delas foram escolhidas para serem expressas em fagos e avaliadas por bioensaios de atividade entomotóxica. Os resultados mostraram que 4 variantes apresentaram atividade entomotóxica específica aumentada em mais de 2 vezes quando comparadas a toxina original. Os genes codantes destas proteínas mutantes foram seqüenciados e as proteínas correspondentes tiveram a estrutura simulada por meio de técnicas de modelagem molecular por homologia, para estudar possíveis implicações das mutações sobre a atividade tóxica. Os estudos moleculares revelaram pequenas variações no contato e distância entre alguns átomos das proteínas mutantes em relação à proteína original. No entanto, tais modificações foram insuficientes para determinar a causa da atividade diferenciada entre mutantes e original, indicando a necessidade de estudos adicionais de interação entre a proteína Cry e o receptor. Portanto, os resultados obtidos validam a estratégia utilizada e disponibilizam novas moléculas candidatas ao controle desta praga em futuros eventos de geração de cana-de-açúcar geneticamente modificada.Tese (Doutorado em Biologia Molecular) - Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas. Orientador: Drª. Maria Fátima Grossi de Sá, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia; Co-orientação: Drª. Maria Cristina Mattar da Silva, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia