Telomere deprotection and the maintenance of genome integrity : discrepancy between telomere shortening and shelterin dysfunction

Els telòmers són estructures nucleoprotèiques que segellen l'extrem cromosòmic i el protegeixen de la reparació il·legítima mitjançant la formació d'un llaç telomèric anomenat t-loop que està modulat per la proteïna TRF2. En les últimes dècades, s'ha demostrat que la disfunció telomèrica és un mecanisme capaç d'originar inestabilitat cromosòmica (CIN) en cèl·lules humanes i de ratolí i promoure la tumorigènesis en models murins. L'objectiu d'aquesta tesi és immortalitzar cèl·lules telomèricament inestables i avaluar el seu potencial tumorigènic mitjançant la desprotecció telomèrica a través de l'escurçament telomèric o de la disfunció de la proteïna TRF2. En el Treball I, cèl·lules epitelials mamàries humanes deficients per p16INK4a (vHMECs) i deficients o no per p53 (p53+/+) foren cariotipades a diferents temps de doblatge per avaluar la presència d'anomalies cromosòmiques i l'evolució del cariotip. En l'absència de la telomerasa, els telòmers s'escurçaren de forma progressiva fins esdevenir desprotegits, i la subseqüent reparació il·legítma dels extrems afavorí l'entrada en cicles de ruptura-fusió-pont (BFB) i disparà la CIN. Tanmateix, les cèl·lules inestables finalment moren independentment de la funcionalitat de p53. Per contra, la sobreexpressió d'hTERT en les cèl·lules vHMEC-p53+/+ afavoreix la proliferació indefinida amb un cariotip gairebé estable, mentre que la immortalització de les cèl·lules vHMEC-shp53 amb signes de CIN és permissiva amb la proliferació cel·lular i l'evolució del cariotip. Al Treball II i al Treball III, la desprotecció telomèrica aguda va ser induïda mitjançant l'expressió transitòria d'un dominant negatiu de TRF2 (TRF2BM). El dany telomèric agut fou avaluat en la línia cel·lular epitelial mamària MCF-10A (Treball II) i en cèl·lules epitelials mamàries (HMECs) immortalitzades derivades de pacients sanes (Treball III). Al Treball II, la desprotecció telomèrica mitjançant TRF2BM generà un increment de TIFs, fusions telomèriques i ponts anafàsics. Els ponts anafàsics es consideren els inductors dels cicles (BFB) i de la posterior reorganització cariotípica. No obstant, no s'observaren reorganitzacions cromosòmiques derivades dels cicles BFB després de l'expressió transitòria del TRF2BM, independentment de la funcionalitat de les proteïnes p53 i pRb. Després de successius cicles de desprotecció telomèrica, s'observà un increment en el nombre de cèl·lules diploides, tot suggerint que l'excessiu dany telomèric evitaria la proliferació d'aquelles cèl·lules que podrien esdevenir altament reorganitzades. Al Treball III s'expressà TRF2BM en HMECs immortalitzades mitjançant hTERT i l'antigen SV40LT (HMEC-TO). L'expressió transitòria del TRF2BM induí l'increment de ponts anafàsics, però les cèl·lules tampoc presentaren reorganitzacions pròpies dels cicles BFB en marxa. A diferència del Treball II, les cèl·lules poliploides incrementaren arrel del procés d'immortalització. Independentment de la causa d'aquest increment en les cèl·lules poliploides, les cèl·lules exposades als cicles d'expressió de TRF2BM no presentaven un fenotip associat a la disfunció telomèrica, ni tampoc un potencial tumorigènic, tot suggerint que l'expressió del mutant TRF2BM provoca un efecte deleteri sobre la viabilitat cel·lular i l'inici de la CIN. En resum, la present tesi evidencia que el grau de dany telomèric és una eina de doble fil en el manteniment de la integritat genòmica. Per una banda, l'escurçament telomèric indueix un dany cel·lular progressiu i lleu, compatible amb la viabilitat cel·lular. Quan el dany telomèric assoleix un cert llindar, la cèl·lula activa mecanismes dependents i independents de p53 que indueixen la seva mort. Pel contrari, la disfunció de TRF2 afecta a un nombre molt elevat de telòmers i indueix una exagerada resposta cel·lular que la fa incompatible amb la viabilitat cel·lular i la reorganització del cariotip. Aquesta tesi demostra que la desprotecció simultània d'un nombre elevat de telòmers pot ser una eina útil per generar un dany al DNA molt elevat i mantenir la integritat genòmica.Telomeres are nucleoprotein structures that cap the end of chromosomes and protect them from illegitimate recombination through a lariat conformation or t-loop that is mainly promoted by TRF2 protein. Dysfunctional telomeres have been proved to be a mechanism capable of originating chromosome instability (CIN) in mouse and human cells, and promote tumorigenesis in mouse models. This dissertation thesis aims to generate immortalised but unstable cells due to telomere deprotection through progressive telomere shortening and by TRF2 depletion, and to evaluate their tumorigenic potential. In Work I, p16INK4a-deficient human mammary epithelial cells (vHMECs) lacking or not for p53 function through specific short-hairpin RNA inactivation, were karyotyped at different population doublings to evaluate chromosomal abnormalities and their evolution. In the absence of telomerase, vHMECs progressively shortened their telomeres and subsequent end-to-end fusions initiated breakage-fusion-bridge (BFB) cycles and promoted CIN. However, these unstable cells finally succumbed to cell cycle arrest, independently of their p53 checkpoint status. In contrast, hTERT overexpression in p53-proficient vHMECs resulted in cells able to proliferate indefinitely with a nearly stable karyotype, while immortalised p53-deficient cells showed signs of CIN that could be permissive with an evolving karyotype. In Work II and Work III, acute telomere deprotection was induced by t-loop disassembly through transient expression of the dominant negative form of TRF2 (TRF2BM) in the mammary cell line MCF-10A and in immortalised HMEC derived from cosmetic reductions of four healthy donors, respectively. In Work II, acute telomere deprotection phenotype was reflected by the presence of TIFs and by an increase of end-to-end fusions and anaphase bridges after TRF2BM induction. Anaphase bridges are considered the prelude to breakage-fusion-bridge cycles and subsequent karyotype reorganisations. However, no scars of BFB cycles or highly reorganised cells have been observed after transient expression of TRF2BM, independently of the status of p53 and pRb proteins. Instead, diploid cells were enriched after successive cycles of telomere deprotection induction, thus suggesting that excessive telomere deprotection could be detrimental for the origin of cells with highly reorganised karyotypes. According with these results, in Work III, immortalised HMEC through hTERT and SV40LT overexpression transiently expressing TRF2BM (HMEC-TO) exhibited an increase of anaphase bridges. But after a minimum of five cycles of telomere protection and deprotection, TRF2BM expressing cells did not display scars of telomere deprotection and ongoing BFB cycles. In contrast to MCF-10A derived cell lines, the HMEC-TO cell lines exhibited a progressive increase of polyploid cells as a consequence of SV40LT immortalisation process. Independently of the cause of polyploidy increase, cells exposed to TRF2BM expression cycles did not exhibit a telomere dysfunction phenotype or either a tumorigenic potential, thus suggesting that TRF2BM expression provoked a deleterious effect over TRF2BM expressing cells and prevented CIN emergence. In conclusion, the present dissertation provides evidence that telomere dysfunction acts as a double sword mechanism for genome integrity. On the one hand, telomere shortening induces a mild and progressive DNA damage that firstly is compatible with cell viability, until damage is high enough to induce cell death. On the contrary, shelterin dysfunction affects widely to all chromosomes inducing an exacerbated cell response that is deleterious for cell viability and karyotype reorganisation. This Thesis illustrate that acute telomere deprotection through shelterin dysfunction could be a useful tool to impinge an exacerbated DNA damage and maintain genome integrity in human mammary cells