Zellbiologische Charakterisierung dermaler Fibroblasten nach Kultur in Cryogelen aus acrylierter Hyaluronsäure

Ziel der vorliegenden Arbeit ist eine erste Bewertung eines neu entwickelten Cryogels auf Basis von acrylierter Hyaluronsäure für den Einsatz als künstliche Extrazellulärmatrix (ECM) zur Unterstützung des Wundheilungsprozesses. Zu diesem Zweck wurden die Cryogele bis zu einer Dauer von 4 Wochen mit Fibroblasten, die neben Keratinozyten, Endothel- und Immunzellen eine besondere Rolle für den Wundverschluss spielen, kultiviert. Dadurch konnten grundlegende Erkenntnisse hinsichtlich der Proliferation, Migration und Matrixsynthese gewonnen werden Ein maßgeblicher Bestandteil war dabei auch die Untersuchung der Genexpression von Kollagen-1 (coll-1), Hyaluronsynthase-2 (HAS-2) und Matrixmetalloproteinase-1(MMP-1) nach Stimulation mit den wundheilungsassoziierten Zytokinen Transforming Growth Factor β (TGF-β ) und Platelet Derived Growth Factor BB (PDGF-BB). Die Produkte der drei Gene spielen für den Wundheilungsprozess eine entscheidende Rolle, da sie wesentlich am Auf- und Umbau der ECM beteiligt sind. Zudem wurden in der Versuchsplanung die Auswirkungen auf Morphologie und Funktion der Fibroblasten bei 3-dimensionaler Kultur im Vergleich zur 2-dimensionalen Monolayerkultur berücksichtigt. Um eine bestmögliche Vergleichbarkeit zu erreichen, wurde aus diesem Grund ein 3-dimensionales Kollagengel als Kontrollmodell genutzt. Die Ergebnisse spiegeln ein physiologisches Verhalten von Fibroblasten bei Kultur in den Cryogelen wider. Die Zellen adhärieren an der Gelstruktur, proliferieren und verteilen sich im Cryogel, indem sie in die Tiefe wandern. In den mikroskopischen und makroskopischen Färbungen zeigt sich eine kontrollierte Neusynthese von ECM. Die Applikation von TGF-β und PDGF-BB führt zu einer adäquaten Reaktion der Fibroblasten und einer Regulation des Matrixstoffwechsels. Die Ergebnisse sind mit denen aus einem 3-dimensionalen Kollagengelmodell vergleichbar und stimmen im Wesentlichen mit der Literatur zur Wirkung der beiden Zytokine auf Monolayerkulturen von Fibroblasten überein. Messungen zeigen eine leichte Zunahme der Porengröße der Cryogele im zeitlichen Verlauf, was möglicherweise auf einen Abbau durch die Fibroblasten hindeutet. Die Stabilität der Gele wird dadurch jedoch nicht merklich beeinflusst. Durch ihre Zusammensetzung und grundlegende Struktur sowie den damit verbundenen Eigenschaften ergeben sich Anwendungsmöglichkeiten sowohl im klinisch-therapeutischen Bereich als auch in der Forschung.:Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Physiologische Wundheilung 1.2. Phasen der Wundheilung 1.2.1. Exsudative Phase 1.2.2. Resorptive Phase 1.2.3. Proliferationsphase 1.2.4. Reparation/Regeneration 1.3. Rolle der Fibroblasten während der Wundheilung 1.4. Einfluss ausgewählter Zytokine auf die Wundheilung 1.5. Rolle der ECM während der Wundheilung 1.5.1. Kollagen 1.5.2. Hyaluronsäure und Hyaluronsynthasen 1.5.3. Matrixmetalloproteinasen 1.6. Probleme bei der Wundheilung und Folgen komplizierter Wunden 1.6.1. Die Brandverletzung - ein Sonderfall der akuten Wunde 1.6.2. Chronische Wunden 1.6.3. Folgen von Wunden und pathologischer Narbenbildung 1.7 Funktionelle Biomaterialien 1.8. Fragestellung und Ziele der Arbeit 2. Materialien 2.1. Nährmedien und Zusätze 2.2. Antikörper, Enzyme und Wachstumsfaktoren 2.3. Chemikalien und andere Substanzen 2.4. Verbrauchsmaterialien 2.5. Geräte 3. Methoden 3.1. Methoden der Zellkultivierung 3.1.1. Isolierung humaner Fibroblasten aus Haut 3.1.2. Dispaseverdau 3.1.3. Kollagenaseverdau 3.1.4. Passagieren der Zellen 3.1.5. Bestimmung der Zellzahl 3.1.6. Aussäen und Kultivierung von Fibroblasten auf Cryogelen aus acrylierter Hyaluronsäure 3.1.7. Aussäen und Kultivierung von Fibroblasten in Gelen aus Kollagen Typ I 3.1.8. Aussäen und Kultivierung von Fibroblasten auf einer Kollagenbeschichtung für die XTT-Messung 3.2. Molekularbiologische Methoden 3.2.1. Isolation der RNA aus Fibroblasten in den Cryogelen aus acrylierter Hyaluronsäure 3.2.2. Isolation der RNA aus Fibroblasten im Kollagengel 3.2.3. Reverse Transkription in cDNA 3.2.4. Die quantitative Real-Time-Polymerasekettenreaktion 3.2.5. XTT-Assay zum Nachweis von Proliferation und metabolischer Aktivität 3.3. Histologische Methoden 3.3.1. Anfertigen von Paraffinschnitten 3.3.2. Färbemethoden der Paraffinschnitte 3.3.3. Immunhistochemie PCNA 3.4. Auswertung der Paraffinschnitte 3.5. Färbung von Gelen mit Siriusrot 3.6. Statistische Auswertung 4. Ergebnisse 4.1. Eigenschaften der Gele 4.2. Histologische Auswertung 4.2.1. Fibroblasten lassen sich im HA-Gel kultivieren 4.2.2. Fibroblasten proliferieren im HA-Gel 4.2.3. Fibroblasten bilden Kollagen und lagern dieses im Gel ein 4.2.4. Messung der Porengröße 4.3. Untersuchung der Stoffwechselaktivität und Proliferation 4.4. Analyse der Genexpression der Fibroblasten nach Stimulation mit TGF-β und PDGF-BB 4.4.1. Untersuchung der Genexpression von Kollagen Typ I 4.4.2. Untersuchung der Genexpression von HAS-2 4.4.3. Untersuchung der Genexpression von MMP-1 4.5. Zusammenfassung der Ergebnisse 5. Diskussion 5.1. Epidemiologie dermaler Verletzungen und die Notwendigkeit neuer Therapien 5.2. Interaktionen der Zellen mit ihrer Umgebung - die Rolle der Kulturbedingungen 5.3. Cryogele aus Hyaluronsäure – ein geeignetes Substrat für die in vitro Kultur von Fibroblasten 5.4. Der Einfluss von TGF-β 1 und PDGF-BB auf den Matrixstoffwechsel der Fibroblasten 5.5. Mögliche Anwendungs- und Entwicklungsmöglichkeiten für Cryogele aus Hyaluronsäure 5.6. Klinische Relevanz der Cryogele in Anlehnung an die derzeitig gültigen Leitlinien 5.7. Fazit Zusammenfassung der Arbeit Literaturverzeichnis Anlagen Histologische Bilder der Alcianblau-HE-Färbung Eigenständigkeitserklärung Lebenslauf DanksagungDie erhobenen Ergebnisse dieser Dissertation zeigen, dass die Zusammensetzung, Struk-tur und damit verbundenen grundlegenden Eigenschaften die Cryogele zu einem geeig-neten Substrat für die 3-dimensionale in vitro Kultur von Fibroblastenmachen. Aus der Literatur ist bekannt, dass eine Besiedelung ähnlich gearteter Hydrogele auch mit anderen Zelltypen möglich ist. Daraus ergeben sich Optionen sowohl für die Anwendung im klinisch-therapeutischen Bereich als auch in der Forschung. Die statistischen Daten verdeutlichen den Innovati-onsbedarf für die Therapie chronischer Wunden und für Alternativen zu Voll-und Spalt-hauttransplantaten bei der Behandlung großflächiger Brandverletzungen. Um für die Be-handlung beider Wundentitäten in Betracht zu kommen, müssen Materialien zur Wund-versorgung den Anforderungen der aktuellen Therapieleitlinien gerecht werden. Aufgrund des natürlichen Vorkommens von Hyaluronsäure im dermalen Gewebe und der Möglichkeit dem körpereigenen Um-und Abbau unterworfen werden zu können, haben die Cryogele entscheidende Vorteile gegenüber bereits zugelassener Materialien, die syn-thetischen oder tierischen Ursprungs sind und nicht selten Allergien oder Fremdkörper-reaktionen hervorrufen. Weitere Eigenschaften der Cryogele lassen vermuten, dass sie mit Hilfe einiger Modifikationen den Kriterien der Leitlinien entsprechen könnten. Die 2-dimensionale Monolayerzellkultur stößt als Forschungsmedium immer dann an ihre Grenzen, wenn die erhobenen Ergebnisse nicht auf die Verhältnisse in vivo übertrag-bar sind. 3-dimensionale Zell-Zell-und Zell-Matrixkontakte sind die Grundlage für eine korrekte Zellfunktion, weswegen die Forderung nach einer Matrix für den Einsatz in der Zellforschung, die die physiologischen Verhältnisse so gut wie möglich abbilden kann, immer präsenter wird. Die Besiedlung der Cryogele aus Hyaluronsäure und anschlie-ßende Untersuchung mit unterschiedlichen Methoden erwies sichim Wesentlichen als unkompliziert. Darüber hinaus zeigten die ausgesäten Fibroblasten eine adäquates Wachstums-und Matrixsyntheseverhalten, weswegen eine Nutzung zu Forschungszwe-cken denkbar erscheint. Die gewonnen Erkenntnisse sowie die in der Diskussion behandelte Literatur und aufgezeigten Möglichkeiten zur Weiterentwicklung der Cryo-gele bilden die Basis für die Planung weiterer und richtungsspezifischerer Untersuchungen.:Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Physiologische Wundheilung 1.2. Phasen der Wundheilung 1.2.1. Exsudative Phase 1.2.2. Resorptive Phase 1.2.3. Proliferationsphase 1.2.4. Reparation/Regeneration 1.3. Rolle der Fibroblasten während der Wundheilung 1.4. Einfluss ausgewählter Zytokine auf die Wundheilung 1.5. Rolle der ECM während der Wundheilung 1.5.1. Kollagen 1.5.2. Hyaluronsäure und Hyaluronsynthasen 1.5.3. Matrixmetalloproteinasen 1.6. Probleme bei der Wundheilung und Folgen komplizierter Wunden 1.6.1. Die Brandverletzung - ein Sonderfall der akuten Wunde 1.6.2. Chronische Wunden 1.6.3. Folgen von Wunden und pathologischer Narbenbildung 1.7 Funktionelle Biomaterialien 1.8. Fragestellung und Ziele der Arbeit 2. Materialien 2.1. Nährmedien und Zusätze 2.2. Antikörper, Enzyme und Wachstumsfaktoren 2.3. Chemikalien und andere Substanzen 2.4. Verbrauchsmaterialien 2.5. Geräte 3. Methoden 3.1. Methoden der Zellkultivierung 3.1.1. Isolierung humaner Fibroblasten aus Haut 3.1.2. Dispaseverdau 3.1.3. Kollagenaseverdau 3.1.4. Passagieren der Zellen 3.1.5. Bestimmung der Zellzahl 3.1.6. Aussäen und Kultivierung von Fibroblasten auf Cryogelen aus acrylierter Hyaluronsäure 3.1.7. Aussäen und Kultivierung von Fibroblasten in Gelen aus Kollagen Typ I 3.1.8. Aussäen und Kultivierung von Fibroblasten auf einer Kollagenbeschichtung für die XTT-Messung 3.2. Molekularbiologische Methoden 3.2.1. Isolation der RNA aus Fibroblasten in den Cryogelen aus acrylierter Hyaluronsäure 3.2.2. Isolation der RNA aus Fibroblasten im Kollagengel 3.2.3. Reverse Transkription in cDNA 3.2.4. Die quantitative Real-Time-Polymerasekettenreaktion 3.2.5. XTT-Assay zum Nachweis von Proliferation und metabolischer Aktivität 3.3. Histologische Methoden 3.3.1. Anfertigen von Paraffinschnitten 3.3.2. Färbemethoden der Paraffinschnitte 3.3.3. Immunhistochemie PCNA 3.4. Auswertung der Paraffinschnitte 3.5. Färbung von Gelen mit Siriusrot 3.6. Statistische Auswertung 4. Ergebnisse 4.1. Eigenschaften der Gele 4.2. Histologische Auswertung 4.2.1. Fibroblasten lassen sich im HA-Gel kultivieren 4.2.2. Fibroblasten proliferieren im HA-Gel 4.2.3. Fibroblasten bilden Kollagen und lagern dieses im Gel ein 4.2.4. Messung der Porengröße 4.3. Untersuchung der Stoffwechselaktivität und Proliferation 4.4. Analyse der Genexpression der Fibroblasten nach Stimulation mit TGF-β und PDGF-BB 4.4.1. Untersuchung der Genexpression von Kollagen Typ I 4.4.2. Untersuchung der Genexpression von HAS-2 4.4.3. Untersuchung der Genexpression von MMP-1 4.5. Zusammenfassung der Ergebnisse 5. Diskussion 5.1. Epidemiologie dermaler Verletzungen und die Notwendigkeit neuer Therapien 5.2. Interaktionen der Zellen mit ihrer Umgebung - die Rolle der Kulturbedingungen 5.3. Cryogele aus Hyaluronsäure – ein geeignetes Substrat für die in vitro Kultur von Fibroblasten 5.4. Der Einfluss von TGF-β 1 und PDGF-BB auf den Matrixstoffwechsel der Fibroblasten 5.5. Mögliche Anwendungs- und Entwicklungsmöglichkeiten für Cryogele aus Hyaluronsäure 5.6. Klinische Relevanz der Cryogele in Anlehnung an die derzeitig gültigen Leitlinien 5.7. Fazit Zusammenfassung der Arbeit Literaturverzeichnis Anlagen Histologische Bilder der Alcianblau-HE-Färbung Eigenständigkeitserklärung Lebenslauf Danksagun