Development of analytical methods for the determination of organic pollutants of the group of dioxins in biological samples and study of the correlation of exposure to environmental stressors with biochemical characteristics

The impact of environment on human health is a scientific field very important for public health attracting interest from researchers worldwide, since there are adequate indications that the pathogenesis of major chronic conditions is caused by the combination of genetic and environmental factors. Despite the fact that the human genome has been decoded, analytical tools that will contribute to the “quantification” of the totality of environmental exposures need to be developed. “Exposome” represents the totality of internal and external human exposures from conception onwards. Exposome research requires the development of analytical methods for the determination of environmental exposures. Persistent organic pollutants, POPs, are very stable, toxic and harmful compounds for humans and for the environment and tend to bioaccumulate in humans and in animal organisms. The aim of the present doctoral thesis is the development of analytical tools in order to examine the impact of POPs on human health. Recent studies have shown that the aforementioned compounds may present their deleterious effects even in very low concentrations (ppt). Consequently monitoring POPs levels is of major importance for the protection of public health and the environment. The present study focuses on dioxin anddioxin-like compounds as well as on perfluoralkylated substances. In particular, a specific analytical method for food analysis was developed and applied for the estimation of dietary exposure which forms the principal route of “external” exposure. Furthermore, a specific analytical method of high sensitivity, necessary due to the limited sample volume, was developed and applied to serum analysis to determine “internal” exposure to these compounds. In the context of the protection of public health, the analytical tools can be used for monitoring of these pollutants on a regular basis. The applied analytical methodology for dioxin compounds in food was based on the use of an active carbon material in combination with other chromatographic materials (silica and alumina) for the specific separation of the compounds of interest. Quality criteria examined (% recovery, accuracy, reproducibility, specificity, limit of quantification), proved the method sensitive and specific enough for food, feed and biological sample analysis. Furthermore the developed method is in accordance with the European Regulation requirements. Application of the method in interlaboratory trials samples as well as in real food samples showed that the new carbon material has high fat capacity and excellent efficiency for the separation of the congeners with good recovery values. Therefore, this method is suitable for the determination of dioxins and dioxin-like compounds (PCDDs, PCDFs and non-ortho PCBs). The above-mentioned analytical method developed for food analysis was adjusted in a lower scale to be applicable to the limited volume (1mL) of serum samples. For this purpose one chromatographic column with a combination of two materials (silica andalumina) was used. During sample preparation, the reduction of experimental steps led to lower sample losses. The total cost as well as the short time required render the method suitable for large sample population. This method was applied to serum samples for the determination of polychlorinated biphenyles (PCBs) which are compounds belonging to the dioxin group. The serum samples were collected from volunteers residing in various areas of the Prefecture of Athens, as well as from volunteers form Aspropyrgos. The results showed higher levels of PCBs in samples of Aspropyrgos inhabitants compared to the rest of the samples. Metabolomic analysis also showed that samples with higher PCB levels presented higher concentrations in metabolites which have been proposed as possible biomarkers of exposure to PCBs. Concerning perfluorinated substances (PFASs), which were also determined in serum samples, concentration levels were in the same range in both populations studied. In the context of the doctoral thesis an estimation of the dietary intake in PCDDs, PCDFs and PCBs of the general population in Greece was attempted for the first time. Representative samples from various food categories were collected andanalyzed during 15 years. For the time period 2016-2018, analyses of food products were carried out with the method developed in the present study. Occurrence data were combined with food availability data collected through household budget surveys presented by the Data Food Networking (DAFNE) initiative, in order to assess the dietary exposure of the Greek population. The food group with the highest total mean upperbound WHO-TEQ concentration (PCDDs, PCDFs and dioxin- like PCBs) was fish and seafood and the one with the lowest mean WHO-TEQ concentration was vegetable oil group. For adult Greek population the average daily intake in PCDDs, PCDFs and dioxin-like PCBs is 1.27 pg WHO-TEQ kg-1 body weight and the average weekly intake is 8.89 pg WHO-TEQ kg-1 body weight. The main contributor to the total dietary intake is the fish and seafood group. Given the current toxicological data, the general background dietary exposure of the Greek population to these compounds is within the tolerable daily intake (TDI) range of 1-4 pg WHO-TEQ kg-1 body weight day-1 proposed by the WHO. However, recently the scientific panel of European Food Safety Authority (EFSA) suggested a tolerable weekly intake of 2 pg WHO-TEQ kg-1 body weight, based on new experimental and epidemiological data. Concerning perfluoroalkylated substances (PFASs), for the general Greek population the estimated average daily dietary intake in PFOA and PFOS, when applying the lowerbound concentrations of food samples is 0.48 and 0.90 ng kg-1 body weight day-1 respectively. Exposure due to tap water estimated for PFOA is 0.006 ng kg-1 body weight day-1 and negligible for PFOS. Oral weekly intake estimated is 6.37 ng kg-1 body weight for PFOS and 3.43 ng kg-1 body weight forPFOA. All estimated values are below the tolerable weekly intake values set by EFSA, 13 ng kg-1 body weight week-1 for PFOS and 6 ng kg-1 body weight week-1 for PFOA.Η επίδραση του περιβάλλοντος στην υγεία είναι ένα επιστημονικό πεδίο που προσελκύει μεγάλο ερευνητικό ενδιαφέρον διεθνώς, καθώς υπάρχουν επαρκείς ενδείξεις ότι πληθώρα χρόνιων ασθενειών προκαλείται από έναν περίπλοκο συνδυασμό γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων. Ενώ το ανθρώπινο γονιδίωμα έχει αποκωδικοποιηθεί, για την μελέτη της επίδρασης του περιβάλλοντος στην υγεία υπάρχει ανάγκη ανάπτυξης εργαλείων που θα συμβάλλουν στην «ποσοτικοποίηση» του συνόλου των περιβαλλοντικών επιδράσεων. Ο όρος “exposome” αντιπροσωπεύει τη συνολική εκτίμηση της έκθεσης του ανθρώπου σε εσωτερικούς και εξωτερικούς παράγοντες από τη σύλληψη έως το θάνατό του. Βασικός πυλώνας της έρευνας πάνω στο“exposome” είναι η ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων για την εκτίμηση της συνολικής έκθεσης σε περιβαλλοντικούς ρύπους. Οι ανθεκτικοί οργανικοί ρύποι (Persistent Organic Pollutants, POPs) είναι οργανικές ενώσεις πολύ σταθερές, τοξικές και ιδιαίτερα επιβλαβείς για τον άνθρωπο και το περιβάλλον οι οποίες διαθέτουν την ικανότητα να βιοσυσσωρεύονται στον οργανισμό των ανθρώπων και των ζώων. Η παρούσα διδακτορική διατριβή έχει σαν σκοπό την ανάπτυξη εργαλείων αναλυτικής χημείας για τη διερεύνηση των επιπτώσεων των POPs στην ανθρώπινη υγεία. Οι ενώσεις αυτές μπορούν να εμφανίσουν τις τοξικές τους δράσεις ακόμα και σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις της τάξης των ppt. Συνεπώς είναι απαραίτητη η παρακολούθηση των επιπέδων των POPs για την προστασία του περιβάλλοντος και της ανθρώπινης υγείας. Η μελέτη επικεντρώθηκε στις ενώσεις της ομάδας των διοξινών και τις υπερφθοριωμένες ενώσεις. Ειδικότερα αναπτύχθηκαν εξειδικευμένες αναλυτικές μέθοδοι για τα τρόφιμα που εφαρμόστηκαν στην εκτίμηση της διατροφικής έκθεσης, η οποία αποτελεί την κύρια οδό «εξωτερικής» έκθεσης. Επιπλέον, αναπτύχθηκε αναλυτική μέθοδος για τον ορό αίματος με αυξημένη ευαισθησία, λόγω περιορισμένου όγκου δείγματος για τον προσδιορισμό των επιπέδων στον ανθρώπινο οργανισμό που αποτελεί την «εσωτερική» έκθεση. Τα εργαλεία αυτά μπορούν να χρησιμεύσουν στο εξής για τη συστηματική παρακολούθηση αυτών των ρύπων στα τρόφιμα και στον γενικό πληθυσμό που είναι απαραίτητη για την προστασία της δημόσιας υγείας. Η ανάπτυξη της μεθόδου για την ανάλυση των ενώσεων της ομάδας διοξινών στα τρόφιμα βασίστηκε στη χρήση νέου τύπου ενεργού άνθρακα σε συνδυασμό με άλλα χρωματογραφικά υλικά (silica και alumina). Τα κριτήρια ποιότητας που εξετάστηκαν κατά την ανάπτυξη της μεθόδου (ανάκτηση επισημασμένου προτύπου, ακρίβεια, αναπαραγωγιμότητα, ειδικότητα και τα όρια ποσοτικοποίησης) την καθιστούν αρκετά ευαίσθητη και εξειδικευμένη για την ανάλυση τροφίμων, ζωοτροφών και βιολογικών δειγμάτων και σε πλήρη συμφωνία με τις απαιτήσεις των σχετικών Ευρωπαϊκών Kανονισμών. Τα αποτελέσματα της μελέτης σε διεργαστηριακά δείγματα και σε δείγματα τροφίμων έδειξαν ότι ο νέος ενεργός άνθρακας έχει καλή ικανότητα διαχωρισμού των υπό μελέτη ενώσεων από το λίπος, ενώ διαχωρίζει επιτυχώς όλα τα ομοειδή με πολύ καλές ανακτήσεις. Συνεπώς αποτελεί αποτελεσματική μέθοδο για τον προσδιορισμό των ενώσεων της ομάδας των διοξινών (PCDDs, PCDFs και τωνnon-ortho PCBs). Η μέθοδος για τα τρόφιμα, προσαρμόστηκε σε μικρότερη κλίμακα για να μπορεί να εφαρμοστεί στον περιορισμένο όγκο των δειγμάτωνορού (1 mL). Για το σκοπό αυτό έγινε χρήση μίας χρωματογραφικής στήλης η οποία περιέχει συνδυασμό δύο υλικών (silica και alumina). Με την ελάττωση των σταδίων, ελαχιστοποιήθηκε και η απώλεια του δείγματος κατά την προκατεργασία. Το συνολικό κόστος καθώς και ο χρόνος που απαιτείται για την ανάλυση, καθιστούν την παρούσα μέθοδο κατάλληλη για την εφαρμογή της σε μεγάλο αριθμό δειγμάτων. Η μέθοδος αυτή εφαρμόστηκε σε δείγματα ορού αίματος για τον προσδιορισμό των επιπέδων πολυχλωριωμένων διφαινυλίων(PCBs), τα οποία ανήκουν στην ομάδα των διοξινών, από εθελοντές που διαμένουν στην περιφέρεια Αττικής καθώς και στην περιοχή του Ασπρόπυργου. Τα αποτελέσματα των αναλύσεων έδειξαν ότι τα δείγματα ορού των εθελοντών που κατοικούν στον Ασπρόπυργο παρουσιάζουν υψηλότερα επίπεδα από εκείνα των εθελοντών που διαμένουν σε άλλες περιοχές της Αττικής. Οι αναλύσεις μεταβολομικής έδειξαν επίσης ότι τα πιο επιβαρυμένα δείγματα ορού παρουσίασαν και αυξημένες συγκεντρώσεις σε μεταβολίτες που χαρακτηρίζονται πιθανοί βιοδείκτες της έκθεσης σε PCBs. Στα δείγματα ορού των εθελοντών προσδιορίστηκαν επίσης τα επίπεδα υπερφθοριωμένων ενώσεων (PFASs) για τα οποία δεν βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο πληθυσμών που μελετήθηκαν. Στο πλαίσιο της διατριβής, πραγματοποιήθηκε για πρώτη φορά εκτίμηση της διατροφικής πρόσληψης των παραπάνω ενώσεων για το γενικό πληθυσμό της Ελλάδας. Μεγάλος αριθμός αντιπροσωπευτικών δειγμάτων από κατηγορίες τροφίμων που καταναλώνονται ευρέως στην Ελλάδα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν κατά τα 14 χρόνια λειτουργίας του εργαστηρίου. Τα τελευταία δύο έτη οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη μέθοδο που αναπτύχθηκε στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής. Τα αποτελέσματα του προσδιορισμού των συγκεντρώσεων των PCDDs, PCDFs και dioxin-like PCBs συνδυάστηκαν με τα δεδομένα διαθεσιμότητας τροφίμων που συλλέχθηκαν σε έρευνα οικογενειακού προϋπολογισμού. Η ομάδα με την υψηλότερη συνολική μέση συγκέντρωση είναι τα ψάρια/θαλασσινά και η ομάδα με τη χαμηλότερη μέση συγκέντρωση είναι τα φυτικά έλαια. Για τον γενικό ενήλικο πληθυσμό στην Ελλάδα, η μέση ημερήσια πρόσληψη σε PCDDs, PCDFs και dioxin-like PCBs υπολογίστηκε 1.27 pg WHO-TEQ kg-1 σωματικού βάρους, η οποία αντιστοιχεί σε εβδομαδιαία πρόσληψη 8.89 pg WHO-TEQ kg-1 σωματικού βάρους. Η κατηγορία τροφίμων που συνεισφέρει τα μέγιστα στη συνολική διατροφική πρόσληψη σε PCDDs, PCDFs και PCBs είναι τα ψάρια/θαλασσινά. Η διατροφική έκθεση του γενικού πληθυσμού ενηλίκων στην Ελλάδα είναι κοντά στα κάτω όρια του εύρους τιμών ανεκτής ημερήσιας πρόσληψης (TDI 1-4 pgWHO-TEQ kg-1 σωματικού βάρους ημέρα-1), όπως προτείνεται από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (WHO), ενώ είναι χαμηλότερη από το ανώτατο όριο εβδομαδιαίας πρόσληψης TWI 14 pg WHO-TEQ kg-1 σωματικού βάρους εβδομάδα-1 που προτάθηκε το 2001 από τη Scientific Committee on Food της Ευρωπαϊκής Ένωσης. Πρόσφατα η Ευρωπαϊκή Αρχή για την ασφάλεια των τροφίμων (EFSA) δημοσίευσε νεότερη γνωμοδότηση με τίτλο: “Scientific opinionon the risk of animal and human health related to the presence of dioxins and dioxin-like PCBs in feed and food” στην οποία προτείνεται χαμηλότερο ανώτατο όριο εβδομαδιαίας πρόσληψης (TWI) 2 pg WHO-TEQ kg-1 σωματικού βάρους εβδομάδα-1, με βάση νεότερα πειραματικά και επιδημιολογικά δεδομένα. Όσον αφορά στα PFASs η εκτιμώμενη ημερήσια πρόσληψη από τη διατροφή σε PFOA και PFOS του γενικού πληθυσμού της Ελλάδας από τα προϊόντα τροφίμων είναι 0.48 και 0.90 ng kg-1 σωματικού βάρους ημέρα-1 αντίστοιχα, ενώ η πρόσληψη από το πόσιμο νερό είναι 0.006 ng kg-1 σωματικού βάρους ημέρα-1 για το PFOA και αμελητέα για το PFOS. Η εβδομαδιαία από του στόματος πρόσληψη υπολογίστηκε 6.37 ng kg-1 σωματικού βάρους για το PFOS και 3.43ng kg-1 σωματικού βάρους για το PFOA. Πρόσφατα προτάθηκαν τιμές ΤWI από την EFSA 13 ng kg-1 σωματικού βάρους-1 για το PFOS και 6 ng kg-1 σωματικού βάρους εβδομάδα-1 για το PFOA. Είναι φανερό ότι η έκθεση του ενήλικου πληθυσμού είναι σε χαμηλότερα επίπεδα από τις προτεινόμενες τιμές