Down regulation of gene expression in Mucor mucedo and Mucor circinelloides by transformation with antisense morpholino oligonucleotides

Die Regulierung der Genexpression unter Verwendung von Antisense-Oligo-Morpholino-Nukleotiden (MO) ermöglicht viele neue Anwendungen. Diese Technik mit MO Nukleotiden wurde zum erstem Mal in Zygomyceten eingesetzt und es gelang die Genexpression von crgA aus Mucor mucedo und die ku70-Genexpressions aus Mucor circinelloides herunter zu regulieren. Stabile genetische Manipulationen in Zygomyceten sind sehr seltene Ereignisse. In der überwiegenden Mehrzahl der Fälle werden die transformierten Vektoren in den Transformanden autonom repliziert. Sowohl ektopische als auch homologe Integration von Vektoren sind äußerst selten zu finden und es ist die Charakterisierung von vielen 100 Transformanden notwendig, um diese Integranten zu finden. Um die Funktionaltät der Methode zeigen zu können, wurden zwei verschiedene MOs entwickelt: das crgA MO wurde abgeleitet von der Sequenz des neu isolierten Genfragments für crgA aus Mucor mucedo. Das ku70 MO wurde aus der Genomsequenz von Mucor circinelloides abgeleitet. Beide Nukleotide habe eine Länge von 25 bp. Die Expression der folgenden Gene soll durch die MOs gesteuert werden. 1. Das crgA Protein ist ein negativer Regulator der Carotinsynthese und ein Abfall der Genexpression sollte zu einer erhöhten Carotin-Synthese führen. Die Zu- oder Abnahme von Carotin kann nach Extraktion aus den Zellen einfach photometrisch bestimmt werden. Das crgA MO wurde mit Hilfe von Elektroporation in Protoplasten von M. mucedo eingeschleust. Es konnte die Zunahme von Carotin nach Behandlung mit crgA MO nachgewiesen werden. Dies ist das erste Transformations-Experiment in M. mucedo. Die Methode zur Protoplastierung von M. mucedo wurde ebenfalls etabliert. 2. Die ku70-Genexpression in Mucor circinelloides wurde ebenfalls durch ein ku70 MO moduliert. Dabei wurde Mucor circinelloides gleichzeitig mit dem ku70 MO und einer mutierten Version des pEUKA4 Vektors transformiert. Das Marker-Gen Leu 2 für die Leucin-Biosynthese enthält eine stille Mutation durch Austausch eines einzelnen Nukleotids, die zu einer neuen XbaI Restriktionserkennungsstelle führt. Dies ermöglicht ein einfacheres Screening von Transformanten, die das Gen homolog integriert haben und unterscheidet diese von möglichen Revertanten. Die Southern-Blot-Analyse der Transformanden zeigten stabile integrative Transformanten und nur wenige, die den Vektor autonom replizieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass MOs die Genexpression blockieren können. In Zukunft könnte diese Technik nützlich sein für die Untersuchung von ausgewählten Genen und der Modulation der Genexpression in Zygomyceten