Calcium dysregulation in mononuclear cells from patients with Amyotrophic lateral sclerosis

Die Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine heterogene, multisystemische Erkrankung, die mit dem selektiven Untergang der oberen und unteren Motoneurone einhergeht. Ein schädigendes Milieu in der Umgebung der Motoneurone wird als bedeutender Faktor in der Pathogenese der ALS gesehen. Eine Verbesserung dieser Umgebungsbedingungen in der initialen Phase der Erkrankung erweist sich als protektiv. Außerdem sind immunologische Veränderungen im Blut und Liquor von ALS-Patienten nachweisbar. Die Isolation von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) ist eine wichtige Methode zur Erforschung erkrankungsspezifischer Biomarker. In der Pathologie der ALS wird ein Zustand beschrieben, in dem das Ca2+-Gleichgewicht zwischen Endoplasmatischem Reticulum (ER) und Mitochondrien dereguliert ist und fehlgefaltete Proteine oberhalb toxischer Konzentrationsschwellen aggregieren. Dies könnte ein Schlüsselprozess sein, der zum Zelluntergang von Motoneuronen führt. Ähnliche Dysregulationen in der Calcium-Homöostase zeigen sich auch in den peripheren Blutzellen der ALS-Patienten. In PBMCs ist eine Vielzahl unterschiedlicher Ca2+-Kanäle, Rezeptoren und Ca2+-bindender Proteine vorhanden, die an der Regulation intrazellulärer Ca2+-Konzentrationen beteiligt sind. Vor allem die auf PBMCs exprimierten P2X-Rezeptoren (P2XRs) spielen eine große Rolle bei der Deregulation der intrazellulären Ca2+-Homöostase. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, eine Verbindung zwischen den P2XRs und der Calcium-Dysregulation in PBMCs durch die Messung intrazellulärer Ca2+-Konzentrationen in vitro zu finden. Außerdem wurde das Expressionslevel des Ca2+ bindenden Proteins Calnexin in Monozyten von ALS-Patienten gemessen und mit denen gesunder Kontrollen verglichen. Dazu wurden Blutproben von 82 ALS-Patienten (48 männliche, 32 weibliche) und 40 alters- und geschlechtskorrelierte Kontrollpersonen (19 männliche, 21 weibliche) gesammelt, um PBMCs zu isolieren. Die Expression von P2X4R und P2X7R wurde mithilfe immunhistochemischer Färbungen und dem Western Blot-Verfahren analysiert. Fura-2 als radiometrischer, fluoreszierender Farbstoff, der spezifisch freies Ca2+ bindet, wurde verwendet, um intrazelluläres Ca2+ zu detektieren. Dabei wurden exogenes Adenosintriphosphat (ATP), Lipopolysaccharid (LPS) als inflammatorischer Stimulus und Thapsigargin genutzt, um Ca2+-Ströme zu induzieren. Die Untersuchung von Veränderungen in der Konzentration Ca2+-bindender Proteine des ERs in Monozyten erfolgte anhand immunhistochemischer Messung des Calnexin-Levels in Monozyten von ALS-Patienten und Kontrollen. Die Auswertung der Western Blot-Ergebnisse ergab keine signifikanten Unterschiede im Proteinlevel der P2X4R-Expression zwischen ALS-Patienten und den Kontrollpersonen, wo hingegen die Expression von P2X7R bei ALS vermindert war. Die Monozyten der ALS-Patienten zeigten nach Induktion durch unterschiedlich hohe ATP-Konzentrationen einen signifikant geringeren Anstieg in der zytosolischen Calcium-Konzentration im Vergleich zu Kontrollen. Ebenso wurde durch LPS ein signifikant geringerer zytosolischer Calcium-Anstieg bei ALS-Patienten ausgelöst. Im Gegensatz dazu konnten massiv erhöhte Calcium-Elevationen nach Thapsigargin-Applikation bei den Monozyten der ALS-Patienten gemessen werden, welches als akuter Inhibitor der Sarco/Endoplasmatisches Reticulum-Calcium-ATPase (SERCA) wirkte. Darüber hinaus wurde Calnexin nach Inkubation mit ER-Stressoren in größerem Ausmaß bei ALS-Patienten nachgewiesen, was auf eine Proteinaggregation im ER hinweist. Diese Dissertation belegt eine Störung des Calcium-Haushaltes in Monozyten von ALS-Patienten. Calnexin ist bei der Calcium-Dysregulation in Monozyten während der Immunaktivierung und des ER-Stresses involviert. Im initialen Stadium stellt die Proteinaggregationen zwar einen protektiven Effekt dar, kann jedoch durch Störung des ERs zu Zytotoxizität im fortgeschrittenem Stadium der ALS führen. Die Ergebnisse dieser Arbeit erklären außerdem auch die Calcium-Überladung in den Monozyten, was durch eine erhöhte Konzentration an Calcium bindenden Proteinen kompensiert sein könnte.Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a heterogeneous multisystemic disease involving the selective loss of upper motor neuron (UMN) and lower motor neuron (LMN). Unsuitable environment for MNs is largely correlated to ALS pathogenesis. It has been shown that improving MNs´ surrounding environment at the initial stage could exert a protection effect. Moreover, immune abnormalities have been found in the blood and CSF of ALS patients. Mononuclear cells from peripheral blood have been revealed as a vital source for establishing disease-specific biomarkers. In ALS it has been described as a condition in which the endoplasmic reticulum (ER)-mitochondria Ca2+ balance is deregulated and misfolded proteins are aggregated above the toxicity threshold. Similar calcium homeostasis dysfunction is also present in peripheral blood cells of ALS patients. In peripheral blood monoculear cells (PBMCs), a large variety of Ca2+ channels, receptors and Ca2+ binding protein are involved in the regulation of intracellular Ca2+ level. Furthermore, P2X receptors (P2XRs), expressed on PBMCs, are highly related to deregulate intercellular Ca2+ homeostasis. In the present dissertation the aim was to find a link between P2XRs and Ca2+ dysregulation in PBMCs by performing the measurement of intracellular Ca2+ levels in vitro. Furthermore, the Ca2+-binding protein (calnexin) expression level in monocytes from ALS patients was compared to controls. Blood samples were collected from 82 ALS patients (male=48, female=32) and 40 age- and gender-matched controls (male=19, female=21) and used for PBMC isolation. The expression of P2X4R and P2X7R was analyzed by immunohistochemistry (IHC) and western blot. Fura-2, a ratiometric fluorescent dye specifically bounded to free Ca2+ was used to detect intercellular Ca2+. Moreover, exogenous adenosine triphosphate (ATP), inflammatory stimulus lipopolysaccharide (LPS) and thapsigargin were used for Ca2+ elicitation. To analyze changes in ER Ca2+-binding proteins of monocytes, differences in calnexin levels between patients and controls were measured by the integrated density. Western blot analyses revealed no significant difference in protein level of P2X4 expression between patients and controls. However, the expression of P2X7R decreased in ALS patients compared with controls. In the monocytes from patients with ALS, the increase of cytosolic Ca2+ induced by different concentrations of ATP was significantly lower than controls. Similarly, the Ca2+ level of controls was significantly higher in terms of elevation of LPS-evoked Ca2+. By contrast, thapsigargin-evoked Ca2+ elevation during acute sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) SERCA inhibition were extremely high in ALS patients. More abundant calnexin was visualized in monocytes from patients, suggesting an ER-related protein aggregation with ER stressor exposures. This work elucidates Ca2+ disturbance in monocytes from ALS patients. Calnexin is involved in the Ca2+dysregulation in monocytes during immune activation and ER stress. At the initial stage, aggregation exerts protective effects, but may become a potential cytotoxic event resulting from impaired ER at the advanced stages of ALS. The results also offer an explanation for overloaded Ca2+ in monocytes which may be buffered by an increase of Ca2+-binding protein