Fluoresenssivärjäysmenetelmän optimointi maitonäytteiden bakteerien värjäämiseen : elävien ja kuolleiden bakteerien osuus utaretulehdusmaidossa

Utaretulehdus eli mastiitti on lypsylehmien yleisin sairaus Suomessa ja sen diagnostiikka perustuu useimmiten kliinisten oireiden lisäksi polymeraasiketjureaktioon tai viljelymenetelmään. Tällä hetkellä utaretulehdusmaitonäytteiden tutkimiseen ei ole saatavilla sellaista menetelmää, jonka avulla voisi saada selville näiden näytteiden elävien ja kuolleiden bakteerisolujen osuudet. LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit (Thermo Fisher Scientific, Yhdysvallat) on fluoresenssiin perustuva kaupallinen väriaineita sisältävä reaktiosarja. Reaktiosarjan SYTO9-väriaine värjää elävät bakteerisolut vihreiksi ja propidiumjodidi kuolleet bakteerisolut punaisiksi. Tätä lisensiaattitutkielmaa tehdessä ei ollut saatavilla julkaisuja, joissa värjäysreaktiosarjaa olisi käytetty utaretulehdusmaidon tutkimiseen. Tutkielman tarkoituksena oli optimoida BacLight-reaktiosarjan käyttö utaretulehdusmaidossa olevien bakteerien värjäämiseen, jotta menetelmää voisi jatkossa käyttää utaretulehdusmaidon bakteerien elinkyvyn tutkimiseen. Tämän tutkielman kirjallisuuskatsauksessa kerrotaan lyhyesti utaretulehduksen diagnostiikassa käytetyistä laboratoriomenetelmistä. Pääpaino kirjallisuuskatsauksessa on kuitenkin fluoresenssiin perustuvissa tutkimusmenetelmissä, ja tutkielmassa vertaillaan erilaisten bakteerien elinkyvyn tunnistamiseen käytettyjen menetelmien ominaisuuksia. BacLight-reaktiosarjan aiempaa käyttöä bakteerien elinkykytutkimuksissa ja havaintoja värjäysreaktiosarjan ominaisuuksista nostetaan esille. Tutkimuksen kokeellisessa osuudessa käytettiin maitonäytteitä, jotka kerättiin vuosina 2016–2017 utaretulehdusta sairastaneilta lehmiltä. Maitonäytteille suoritettiin kolme esikoetta, joiden avulla pyrittiin löytämään optimaalisin käsittelytapa maitonäytteille ennen varsinaisia värjäyskokeita. Esikokeiden jälkeen suoritettiin kuusi ennalta sovittua värjäyskoetta, joissa maitonäytteissä olevien bakteerien värjäykseen käytettiin BacLight-reaktiosarjaa. Osaan maitonäytteistä lisättiin Staphylococcus simulans -bakteereita, jotta varmistuttiin siitä, että ainakin osassa maitonäytteistä olisi detektioon riittävä määrä bakteerisoluja. Kokeissa vertailtiin muun muassa väriaineiden eri suhteita sekä inkubaatioajan ja resuspensointitilavuuden vaikutusta maitonäytteiden bakteerien elinkyvyn tutkimiseen. Värjätyt maitonäytteet tutkittiin mikroskoopilla ja elävien ja kuolleiden bakteerisolujen laskeminen tehtiin mikroskoopin avulla otetuista valokuvista. Hypoteesi oli, että valmistajan antama käyttöprotokolla olisi optimaalisin myös utaretulehdusmaitoa tutkittaessa. Tutkimuksessa todettiin, että värikomponenttien suhteen muuttaminen ja inkubaatioajan pidentäminen valmistajan ohjeista heikensivät bakteerien erottuvuutta. Myös resuspensointitilavuuden pienentäminen heikensi maitonäytteiden bakteerien erottuvuutta ja hankaloitti laskemista. Optimaalisin värjäystapa maitonäytteille oli BacLight-reaktiosarjan valmistajan antama värjäysmenetelmä. Lopputuloksena voidaan todeta, että BacLight-reaktiosarjaa voidaan käyttää maitonäytteiden käsittelyyn, mutta lisätutkimuksia tulisi tehdä, jotta menetelmästä saisi suurimman hyödyn. BacLight-reaktiosarjaa voisi jatkossa käyttää esimerkiksi utaretulehdushoidon tehoa tutkittaessa