Human Protein Phosphatase Interactions and Dynamics : Proteomic and Functional Perspective

Nearly all eukaryotic processes are regulated by cyclic phosphorylation-dephosphorylation of cellular signaling proteins, catalyzed by protein kinases and phosphatases, respectively. Until now, the kinases dominated the scientific research, however, in recent years only, the protein phosphatases have emerged as crucial regulators for setting up the levels and amplitude of phosphorylation-driven signaling events. Nevertheless, our molecular and biological awareness of these enzymes is still poor. This thesis aims to gather information on these vital aspects of phosphatase biology. Through our high-throughput systematic affinity-purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) approach, we provide the first glimpse on the cellular protein protein interactions and functional networks of human protein phosphatases from three broad families: phosphoprotein phosphatase, metal-dependent phosphatase, and protein tyrosine phosphatase. Next, we obtained the comprehensive view on their enzymatic structure-activity relationship by utilizing inhibitor Okadaic acid, revealing the effect of catalytic disruption on the phosphatase interaction profile and on the phosphorylation status of their various sub-complex components. From here, we expanded the thesis by investigating the functional relevance of unique phosphates-kinase interaction in the context of specific signaling. From dephosphorylation and luciferase assays we established the role of PTPRA phosphatase in negatively regulating RET kinase activities and its down-stream Ras-MAPK pathway, showing RET as novel PTPRA substrate. By including RET cancer mutants- MEN2A and MEN2B, we, further, shed light on the tumor suppressor functions of PTPRA in human cancers. Taken together, this thesis not only provides a global landscape of human protein phosphatase complexes and their functions but also furnish a reliable resource for futuristic investigations.Lähes kaikkia eukaryoottisia prosesseja säätelee proteiinikinaasien ja fosfataasien katalysoimien solusignalointiproteiinien syklinen fosforylaatio-defosforylaatio. Tähän saakka kinaasit hallitsivat tieteellistä tutkimusta, mutta vain viime vuosina proteiinifosfataasit ovat kehittyneet keskeisinä säätäjinä fosforylaation ohjaamien signalointitapahtumien tasojen ja amplitudin määrittämiseksi. Näiden entsyymien molekyyli- ja biologinen tietoisuus on kuitenkin edelleen huono. Opinnäytetyön tavoitteena on kerätä tietoa näistä tärkeistä fosfataasibiologian näkökohdista. Suuritehoisen systemaattisen affiniteettipuhdistuksemme, joka on yhdistetty massaspektrometriaan (AP-MS), avulla tarjoamme ensimmäisen katseemme soluvalkuaisproteiinien vuorovaikutuksiin ja ihmisen proteiinifosfataasien toiminnallisiin verkkoihin kolmesta laajasta perheestä: fosfoproteiinifosfataasi, metallipohjainen fosfataasi ja proteiinityrosiinifosfataasi. Seuraavaksi saimme kattavan kuvan niiden entsymaattisesta rakenteen ja aktiivisuuden suhteesta käyttämällä inhibiittoria Okadaic-happoa, paljastamalla katalyyttisen häiriön vaikutuksen fosfataasi-vuorovaikutuksen profiiliin ja niiden eri kompleksikomponenttien fosforylaatiotilaan. Tästä lähtien laajensimme opinnäytetyötä tutkimalla ainutlaatuisen fosfaatti-kinaasivuorovaikutuksen toiminnallista merkitystä tietyn signaloinnin yhteydessä. Defosforylaatio- ja lusiferaasimäärityksistä totesimme PTPRA-fosfataasin roolin RET-kinaasiaktiivisuuden negatiivisessa säätelyssä ja sen alaspäin virtaavassa Ras-MAPK-reitissä, mikä osoittaa RET: n uutena PTPRA-substraattina. Mukaan lukien RET-syöpämutantit - MEN2A ja MEN2B, valaisimme lisäksi PTPRA: n tuumorisuppressorifunktioita ihmisen syövissä. Yhteenvetona tämä väitöskirja tarjoaa paitsi ihmisen proteiinifosfataasikompleksien globaalin maiseman ja niiden toiminnot, myös tarjoaa luotettavan resurssin futuristisille tutkimuksille