Papumaiseen flavorikirjoon kuuluvien haihtuvien yhdisteiden muodostuminen härkäpavussa ja lupiinissa eri lipidisubstraateista

Tiivistelmä/Referat – Abstract Elintarvikkeissa palkokasvien käyttöä hankaloittaa ei-toivottujen haihtuvien yhdisteiden muodostuminen elintarvikematriisiin varastoinnin sekä prosessoinnin aikana. Nämä haihtuvat yhdisteet aiheuttavat papumaista flavoria, mistä johtuvat aistinvaraiset ongelmat palkokasvimatriiseissa. Koska haihtuvien yhdisteiden muodostuminen on nopeaa, entsymaattisella hapettumisella on suuri merkitys lipidien hapettumisreaktioissa palkokasveilla. Tutkielman kirjallisuusosassa perehdyttiin lipidien hapettumismekanismeihin, entsyymeihin sekä papumaiseen flavoriin kuuluvien haihtuvien yhdisteiden muodostumiseen palkokasvimatriiseissa. Tutkielman kokeellisessa osassa tavoitteena oli tutkia, miten härkäpavun ja lupiinin eri endogeeniset entsyymit pystyvät muodostamaan haihtuvia yhdisteitä erilaisista lipidisubstraateista. Lipoksigenaasientsyymin aktiivisuus sekä käytetyt inkubaatio- ja mittausolosuhteet optimoitiin ensin, ja optimoituja olosuhteita käytettiin analysoitaessa varsinaisia näytteitä. Tutkimuksen näytematriisina toimi neljä härkäpapulajiketta ja kaksi lupiinilajiketta. Palkokasvimatriisit esikäsiteltiin jauhamalla palkokasvin pavut tiettyyn partikkelikokoon. Jauhot lietettiin veteen entsyymien uuttamiseksi, ja entsyymiuutteita käytettiin lipoksigenaasientsyymin aktiivisuuden määrityksessä sekä haihtuvien yhdisteiden tuotossa. Lipoksigenaasin merkittävän roolin vuoksi lipidien entsymaattisessa hapettumisessa sen optimiolosuhteet haarukoitiin pH:n osalta molemmille palkokasvimatriiseille UV/VIS-spektrofotometrisesti, mikä osoittautui parhaaksi pH:ssa 6. Haihtuvien flavoriyhdisteiden muodostumista ja mittausolosuhteita optimoitiin HS-SPME-GC-MS-laitteistolla (kiinteäfaasimikrouutto-kaasukromatografiamassaspektrometrisesti) käyttäen optimoituja olosuhteita varsinaisten näytteiden mittauksissa. Lisäksi tutkittiin palkokasvinäytteiden lipaasientsyymin aktiivisuutta sekä lipoksigenaasientsyymin tuotespesifiyttä. Molempien palkokasvien lipoksigenaasientsyymien optimi-pH oli 6, joten haihtuvien yhdisteiden tuottoa tutkittiin tässä pH:ssa. Kvantitatiivisesti ja kvalitatiivisesti haihtuvia flavoriyhdisteitä muodostui eniten linolihapon toimiessa substraattina, jolloin muodostui erilaisia alkoholeja, ketoneita, aldehydejä sekä furaaneita. Heksanaalia muodostui eniten linolihapon toimiessa substraattina ja vähiten α-linoleenihapon toimiessa substraattina. Trilinoleiinin sekä rypsiöljyn toimiessa substraatteina haihtuvista flavoriyhdisteistä analysoitiin vain aldehydejä ja ketoneja sekä kvantitatiivisesti että kvalitatiivisesti vähemmän, kuin linolihapon toimiessa substraattina. Rypsiöljyn saippuoituminen paransi haihtuvien flavoriyhdisteiden muodostusta, jolloin analysoitiin em. yhdisteryhmien lisäksi alkoholeja sekä furaaneja. Lisäksi haihtuvia yhdisteitä syntyi huomattavasti enemmän saippuoidusta rypsiöljystä kuin käsittelemättömästä rypsiöljystä. Härkäpavun ja lupiinin lipoksigenaasin havaittiin tuottavan linolihaposta erilaiset hydroperoksidit: härkäpavussa syntyi enemmän 13-hydroperoksideja kuin 9-hydroperoksideja ja lupiinista syntyi vain 13-hydroperoksideja. Käytetyllä analyysimenetelmällä ei voitu havaita vapaiden rasvahappojen syntyä, mikä olisi osoittanut lipaasiaktiivisuutta härkäpapu- ja lupiiniuutteissa. Tulos ei kuitenkaan yksiselitteisesti kerro, että palkokasvimatriiseissa ei ollut lipaasiaktiivisuutta. Molemmat palkokasvimatriisit muodostivat monenlaisia haihtuvia yhdisteitä erilaisista lipidisubstraateista tutkituissa olosuhteissa, joten haihtuvien yhdisteiden muodostumisella on aistinvaraista laatua heikentäviä vaikutuksia palkokasvimatriiseissa. Koska suurin osa elintarvikematriiseista esiintyy aika neutraaleissa pH-arvoissa, on haihtuvien yhdisteiden muodostuminen palkokasveja sisältäviin elintarvikematriiseihin erittäin todennäköistä oikeanlaisten substraattien sekä olosuhteiden läsnäollessa. Entsyymien inaktivointia voidaan tehdä esimerkiksi lämpötilaa nostamalla elintarvikematriisin ravitsemuksellisen arvon kuitenkin laskiessa.Tiivistelmä/Referat – Abstract In food matrices usage of legumes is challenging due to formation of volatile compounds during storage and processing. These volatile compounds form beany flavors, which cause sensory problems in food matrices. Because the formation of volatile compounds in legume matrices is quite quick, it is supposed that enzymatic oxidation is significant when lipids are oxidized in legume matrices. The literature review of this thesis focused on the mechanisms of lipid oxidation in plants, enzymes and formation of volatile compounds in food matrices. The aim of the experimental part was to investigate how volatile compounds are formed from different faba bean and lupine cultivars by endogenic enzymes using different lipid substrates. The activity of lipoxygenase and incubation conditions were optimized at first and those conditions were used to analyse the actual samples. The main legume matrix in this study was faba bean (4 cultivars) and two lupine cultivars were also investigated. The selected legumes were pretreated by grinding the dried pods of legumes in certain particle size. Legume flours were mixed with water to prepare slurries to extract the endogenic enzymes of legume matrices. Due to lipoxygenase’s significant role in enzymatic oxidation of lipids the optimum pH-level of lipoxygenase was determined by using UV/VIS-spectrophotometer. The optimum pH-level for lipoxygenase was found at the pH 6. Optimization and formation of volatile compounds was determined by using HS-SPME-GC-MS-method. In addition, the activity of lipase and product specificity of lipoxygenase (formation of hydroperoxides) were determined. In both legume matrices the pH-optimum of lipoxygenase was at 6 and all the actual samples were measured at that pH. Quantitatively and qualitatively the widest spectrum of volatile compounds was formed when using linoleic acid as a substrate. The spectrum of volatile compounds included different alcohols, ketones, aldehydes and furans. The amounts of hexanal were at the highest when using linoleic acid as a substrate and the lowest when using α-linolenic acid as a substrate. When using trilinolein and rapeseed oil as substrates aldehydes and ketones were the only volatile compounds which were formed. Saponification of rapeseed oil improved the formation of the volatile compounds. In addition, from the saponified rapeseed oil a wider spectrum of volatile compounds were formed when compared to untreated rapeseed oil. The lipoxygenases of faba bean and lupine were shown to form different types of hydroperoxides from linoleic acid: the faba bean produced more 13-hydroperoxides than 9-hydroperoxides and lupine produced only 13-hydroperoxides. Used method when measuring the formation of free fatty acids of legume matrices did not revealed the activity of lipase. On the other hand, this result only tells that lipase activity couldn’t be measured by using this particular method and other methods could reveal lipase activity on those legume matrices. Both of the legume matrices formed different kinds of volatile compounds from different lipid substrates in certain reaction conditions. When those volatile compounds are formed in foods containing legume matrices they lower the sensory value of those foods. The formation volatile compounds in food matrices containing legumes is very plausible due to food matrices pH-level (many of them are at neutral) and usage of suitable lipid substrates and reaction conditions. Inactivation of enzymes can be obtained for example by heating, which could at the same time lower the nutritional value of foods