Glucuronidation activity of individual UDP-glucuronosyltransferases : Comparison of activity and substrate specificity among recombinant human UGT enzymes and differences between dog and human subfamily 1A UGT enzymes

UDP-glucuronosyltransferases (UGTs) are a group of important conjugation enzymes that transfer a sugar moiety from UDP-glucuronic acid onto a nucleophilic group in substrate compounds. This glucuronidation reaction converts compounds into more water-soluble forms, and thereby enhances their excretion into bile, feces or urine. Frequently prescribed drugs are often eliminated through glucuronidation. Normally, several of the 19 human UGTs may participate in the glucuronidation of a certain drug. Occasionally, however, the formed glucuronide originates from the activity of just one particular UGT. Therefore, the published papers in this thesis aimed not only to determine the overall formation of glucuronides, but to characterize the activity of individual UGTs. The experimental design was to express UGTs as recombinant proteins in insect cells and to test their individual activities with several drugs or probe substrates. In some publications, results with recombinant UGTs were compared to results from glucuronidation activity in tissue microsomes. The results revealed that UGT1A4-P24T polymorphism affects the signal sequence cleavage and the length of the mature protein. The observed kinetic behavior suggests that the variant enzyme consists of active and inactive forms of UGT1A4. Similarly, an inactive form of an enzyme could explain the difference in activities between the commercial UGT1A10 and our highly active UGT1A10. The results indicated that the role of UGT1A10 in the small intestine is significantly more substantial than previously thought. Activity of UGT1A10 was also investigated in another article, which identified UGTs that glucuronidate two structurally similar environmental toxins, bisphenols S and F. Bisphenol S is a good substrate for UGT1A9, whereas bisphenol F is a better substrate for the highly homologous UGT1A10. Catalytic differences between many UGTs were studied in the presence or absence of bovine serum albumin and differences were found in a compound-dependent manner. Difference in activities of dog and human UGT1As was the subject of another paper. Results revealed that, perhaps with the exception of UGT1A6, human and dog UGT1A counterparts do not exist. Consistently, in liver and intestinal microsomes, there were large differences between dog and human in glucuronidation rates for a set of test substrates.UDP-glukuronosyylitransferaasit (UGT:t) ovat entsyymejä, jotka siirtävät sokeriryhmän UDP-glukuronihapolta rasvaliukoisiin kohdemolekyyleihin. Kohdemolekyylin rakenne muuntuu siten vesiliukoisemmaksi, mikä helpottaa sen poistumista elimistöstä sapen, ulosteen tai virtsan mukana. Monet lääkeaineet poistuvat elimistöstä UGT-entsyymien reaktiotuotteina eli glukuronideina. Ihmisillä on 19 UGT-entsyymiä, joista yleensä useampi eri UGT osallistuu tietyn lääkeaineen poistoon. Joissain tapauksissa muodostunut glukuronidi on kuitenkin peräisin vain yhden tietyn UGT:n toiminnasta. Tästä syystä väitöskirjan julkaisuissa karakterisoitiin yksittäisten entsyymien aktiivisuuksia. Tuotimme tutkittavat UGT:t hyönteissoluissa ja määritimme niiden entsyymiaktiivisuudet joko lääkeaineita tai muita yleisesti käytettyjä UGT-substraatteja kohtaan. Osassa julkaisuja yksittäisten UGT:ien aktiivisuuksia verrattiin myös vastaaviin maksa- ja ohutsuolimikrosomeilla tehtyihin aktiivisuuksmäärityksiin. Julkaisujen tulokset osoittivat, että aminohappomuutos UGT1A4-P24T variantissa vaikuttaa signaalisekvenssin katkaisuun ja valmiin proteiinin pituuteen. Havaittu ero villityypin ja UGT1A4-P24T:n entsyymiaktiivisuuksissa voisi aiheutua siitä, että varianttientsyymi koostuu aktiivisesta ja ei-aktiivisesta muodosta UGT1A4:ää. Toimimaton entsyymimuoto voisi myös selittää aktiivisuuseron kaupallisen UGT1A10:n ja meidän tuottamamme aktiivisen UGT1A10:n välillä. Lisäksi tulokset viittaavat siihen, että UGT1A10:n merkitys ohutsuolessa on paljon suurempi kuin on aikaisemmin ajateltu. UGT1A10:n aktiivisuutta tutkittiin myös artikkelissa, missä identifioitiin entsyymit jotka osallistuvat kahden rakenteellisesti toisiaan muistuttavan ympäristömyrkyn poistumiseen. Näistä bisfenoli S poistuu UGT1A9:n katalysoimana, kun taas bisfenoli F on parempi kohdemolekyyli hyvin homologiselle UGT1A10:lle. Eri UGT:den toiminnan eroavaisuuksia tutkittiin lisäämällä inhibiittoreja sitovaa albumiinia reaktioseokseen, ja havaitut eroavaisuudet olivat sekä entsyymistä että yhdisteestä riippuvaisia. Julkaisu koiran ja ihmisen UGT1A-entsyymeistä paljasti, että kenties lukuunottamatta UGT1A6-entsyymejä, ihmisellä ja koiralla ei ole samankaltaisesti toimivia UGT1A:ta. Vastaavasti myös koiran ja ihmisen maksa- ja ohutsuolimikrosomeissa oli suuria eroavaisuuksia reaktionopeuksissa testattavia substraatteja kohtaan