Human Pluripotent Stem Cells and CRISPR-Cas9 Genome Editing to Model Diabetes

Pancreatic beta-cell dysfunction is the ultimate cause behind all forms of diabetes. Decades of research with different animal and cellular models have expanded the knowledge on the heterogeneous molecular mechanisms causing the disease. However, they present important limitations that may significantly affect the way these findings can be translated into new approaches to combat diabetes in humans. Rodent pancreatic islet development and physiology display species-specific particularities when compared to human. Similarly, rodent and human insulinoma cell lines are a convenient research tool but do not recapitulate faithfully the functionality of adult human beta-cells. To validate if the findings obtained with these models extrapolate to humans, diabetes researchers have traditionally used cadaveric donor human islets. Primary islets are scarce, highly variable in their composition and functionality and difficult to manipulate for certain experiments. As an alternative, human pluripotent stem cells (hPSC) constitute a renewable source of beta-cells. Stem cell-derived beta-cells can be generated by directed differentiation and used as a model to study pancreatic beta-cell development and disease in vitro. They can also be transplanted into immunocompromised mice, generating humanized models where in vivo beta-cell function can be closely evaluated in a systemic context. The goal of this thesis work was to demonstrate the use of human pluripotent stem cells as a tool to investigate monogenic diabetes disease mechanisms. For this purpose, improved hPSC differentiation protocols to the beta-cell lineage were generated utilizing 3D suspension culture approaches. Transplantation procedures were devised to create humanized mouse models that allow proper evaluation of beta-cell function in vivo. Novel CRISPR-Cas9-based techniques were established and utilized to edit the genome of hPSC and control gene transcription. Precise genome editing made possible the generation of isogenic, mutation-corrected patient-derived induced PSC, enabling the disease modeling of monogenic diabetes cases. Using these approaches, an activating mutation in STAT3 gene was found to cause neonatal diabetes by inducing pancreas endocrinogenesis prematurely, via direct induction of master endocrine transcription factor NEUROG3. In a similar way, INS gene mutations causing proinsulin misfolding were found to impair developing beta-cell proliferation due to increased endoplasmic reticulum stress. Taken together, this thesis work highlights the versatility of hPSC combined with genome editing and transplantation as a useful approach to better elucidate and understand human diabetes.aiman beetasolujen toiminnan häiriö on kaikkien diabetesmuotojen tärkeä aiheuttaja. Kokeellinen tutkimus eläin- ja solumalleilla on paljastanut monia molekulaarisia mekanismeja beetasolujen toimintahäiriön taustalla. Perinteisesti käytettävissä olleilla tutkimusmalleilla on kuitenkin huomattavia rajoituksia, esimerkiksi jyrsijöiden fysiologia eroaa huomattavasti ihmisestä. Kasvainperäiset beetasolulinjat eivät myöskään edusta luotettavasti normaalien solujen toimintaa. Paras solumalli on elinluovuttajien haimasta eristetyt Langerhansin saarekkeet. Näiden saatavuus on kuitenkin hyvin rajallinen eivätkä ne sovi moniin tutkimuskysymyksiin. Ihmisen monikykyiset (pluripotentit) kantasolut tarjoavat teoriassa rajattoman solulähteen beetasolujen tuottamiseksi. Kantasoluista voidaan erilaistaa beetasoluja, jotka edustavat haluttua genotyyppiä, ja täten mallintaa beetasolujen kehityksen ja diabeteksen kehittymisen mekanismeja. Näitä soluja voidaan myös siirtää immuunipuutteisiin hiiriin ja täten luoda ”humanisoituja” hiirimalleja, joiden avulla beetasolujen toimintaa voidaan tutkia myös systeemitasolla. Tämän väitöskirjatutkimuksen tavoite oli osoittaa, että ihmisen pluripotenttien kantasolujen avulla voidaan selvittää geneettisistä syistä johtuvien diabetesmuotojen syntymekanismeja. Tutkimusta varten kehitettiin uusia menetelmiä kantasolujen erilaistamiseksi kohti kolmiulotteisia hormoneja tuottavia soluryppäitä, jotka läheisesti muistuttavat ihmisen haimasaarekkeita. Soluja siirrettiin myös immuunipuutteisten hiirten munuaiskapselin alle. Uusia genominmuokkausmenetelmiä kehitettiin perustuen CRISPR-Cas9-teknologiaan. Näiden lähestymistapojen avulla pystyttiin luomaan isogeenisia solumalleja, joiden genotyyppi eroaa ainoastaan tutkittavan mutaation suhteen. Tätä mallia sovellettiin yhden geenin aiheuttaman (monogeenisen) vastasyntyneellä ilmenevän diabeteksen tutkimukseen. Tutkimusten perusteella osoitettiin STAT3-geenin aktivoivan mutaation johtavan haiman kehityshäiriöön ja diabetekseen perustuen kehittyvien haiman saarekesolujen ennenaikaiseen erilaistumiseen, joka liittyy NEUROG3-geenin säätelyhäiriöön. Samanlaisia menetelmiä käyttäen osoitettiin INS-geenin mutaatioiden johtavan kehittyvien beetasolujen kasvun häiriintymiseen, mikä selittää diabeteksen syntyä pian syntymän jälkeen. Yhteenvetona väitöskirjassa on kehitetty uudenlaisia tapoja hyödyntää ihmisen monikykyisiä kantasoluja diabeteksen syntymekanismien selvittämiseksi. Menetelmillä on ilmeisiä etuja perinteisiin tutkimusmalleihin verrattuna