Novel Approaches for Pluripotent Reprogramming

Somatic cells can be reprogrammed to pluripotent state by ectopic expression of a defined set of transcription factors. These induced pluripotent stem cells (iPSC) hold great potential for biomedical applications, such as disease modelling, drug discovery and cell therapies. The derivation of iPSCs is a complex multistep process that can commonly result in inefficient or incomplete conversion of the cells. The reprogramming efficiency and the quality of the reprogrammed cells can be affected by various components of the reprogramming method, including reprogramming vectors, starting cell populations and the choice of reprogramming factors. The aim of this thesis was to explore novel approaches for improving the pluripotent reprogramming outcome. The particular aims of this thesis were to investigate the use of recombinant Adeno-associated virus (rAAV) as a gene transfer vector for cellular reprogramming, characterization of the effects of old donor age and long term passaging on the reprogramming of fibroblasts, and development of reprogramming methods based on CRISPR/Cas9-mediated activation of endogenous reprogramming factors. In this study, rAAV-mediated transduction of mouse embryonic fibroblasts with OCT4, SOX2, KLF4 and C-MYC was found to successfully induce reprogramming to pluripotency. Unlike initially expected, the AAV vectors were integrated with high efficiency into the host genome during the reprogramming process, resulting in all analyzed iPSCs containing vector integrations. Both donor age and the culture time of the donor fibroblasts correlated with reduction in pluripotent reprogramming efficiency. This effect was found to be associated with upregulation of cellular P21 expression and reduction in cell proliferation. Downregulation of P21 expression by siRNA treatment was able to promote reprogramming of late passage senescent fibroblasts. By optimizing the reprogramming factor guide composition, CRISPR/Cas9-mediated gene activation (CRISPRa) could be used to derive iPSCs reprogrammed fully by targeted activation of endogenous genes. The efficient reprogramming of somatic cells by CRISPRa was found to be dependent on the inclusion of additional guides targeting an embryonic genome activation enriched Alu-motif. Due to the direct targeting of endogenous loci and the high multiplexing capacity of CRISPRa, the reprogramming approach has a high potential for mediating comprehensive and specific reprogramming. Overall, this thesis provides a number of novel tools and insights into the pluripotent reprogramming process. The results of this work can be used to develop more robust reprogramming methods and to improve the quality of reprogrammed cells.Erilaistuneita soluja voidaan uudelleenohjelmoida monikykyiseen (pluripotenttiin) tilaan ilmentämällä niissä määrättyjä geeninsäätelytekijöitä. Nämä indusoidut pluripotentit kantasolut (iPS-solut) ovat hyödyllisiä erilaisiin biolääketieteellisiin sovelluksiin, kuten tautimallinnukseen, lääkeainekehitykseen sekä mahdollisiin soluterapioihin. iPS-solujen ohjelmointi on monivaiheinen ja monimutkainen prosessi, joka saattaa johtaa solujen tehottomaan tai epätäydelliseen muuntautumiseen takaisin kantasolutilaan. Monet ohjelmointimenetelmien osat saattavat vaikuttaa ohjelmoinnin tehokkuuteen tai ohjelmoitujen solujen laatuun. Näihin kuuluvat muun muassa käytetyt geeninsiirtovektorit, ohjelmoitavat lähtösolupopulaatiot tai ohjelmointiin käytettävät geeninsäätelytekijät. Tämän tutkimuksen päämääränä on ollut etsiä uusia menetelmiä, joilla uudelleenohjelmoinnin lopputuloksia saadaan parannettua. Tarkemmat tavoitteet väitöskirjatyölle ovat olleet: tutkia rekombinantin Adeno assosioidun viruksen (rAAV) käyttöä geeninsiirtovektorina solun uudelleenohjelmointia varten, selvittää ikääntymisen ja pitkäaikaisen soluviljelyn vaikutukset fibroblastien ohjelmointiin sekä kehittää solun omien geenien aktivaatiota hyödyntäviä CRISPR/Cas9-pohjaisia menetelmiä solujen uudelleenohjelmointiin. Hiiren alkion fibroblastien transduktio rAAV pohjaisilla OCT4, SOX2, KLF4 ja MYC siirtogeeneillä johti onnistuneesti pluripotenttien solujen ohjelmointiin. Toisin kuin alun perin odotettiin, AAV vektorit integroituivat tehokkaasti ohjelmoitumisen aikana kohdesolujen genomiin ja kaikista tutkituissa iPS-soluklooneissa löytyi genomisia AAV vektorien sekvenssejä. Sekä luovuttajan korkea ikä, että pitkäkestoinen soluviljely laskivat uudelleenohjelmointitehokkuutta. Tämä ilmiö liittyi kohonneeseen P21 geenin ilmentymiseen sekä hidastuneeseen solunjakautumiseen. P21 ilmenemistason laskeminen siRNA välitteisesti edisti pitkään viljeltyjen hitaasti kasvavien solujen ohjelmointia. Optimoimalla uudelleenohjelmointigeenien aktivaatiota kohdentavien opas-RNA molekyylien koostumusta, saatiin CRISPR/Cas9 välitteisellä geeniaktivaatiolla (CRISPRa) aikaan iPS-soluja. Tehokas erilaistuneiden solujen uudelleenohjelmointi oli riippuvainen ylimääräisistä opas-RNA molekyyleista, jotka kohdensivat alkion genomin aktivaation alueille rikastunutta Alu-sekvenssi. Koska CRISPRa:lla saa kohdennettua suurella kapasiteetilla suoraan solun omia geenejä aktivoitavaksi, menetelmällä on varteenotettava mahdollisuus välittää tehokkaasti ja kokonaisvaltaisesti solutilan tarkkaa uudelleenohjelmointia. Kaikkiaan tämä väitöskirjatyö tarjoaa monia uusia työkaluja ja näkemyksiä solujen uudelleenohjelmointiin. Tämän työn tuloksia voidaan käyttää yhä luotettavampien ohjelmointimenetelmien kehittämiseen sekä ohjelmoitujen solujen laadun parantamiseen