Development of a reporter-based assay for the discovery of secondary metabolites in Actinobacteria

Pflanzen, Tiere und Mikroorgansimen stellen eine reiche Quelle für Sekundärmetaboliten dar. Viele dieser natürlichen Produkte, darunter Antibiotika, spielen in der Medizin neben anderen Bereichen wie zum Beispiel in der Landwirtschaft eine wichtige Rolle. Seit Alexander Flemings Entdeckung des Penicillins 1928 und dem später folgenden, sogenannten goldenen Zeitalter der Antibiotika Forschung und der erfolgreichen Anwendung vieler der dabei gefundenen Wirkstoffe in der Therapie von infektiösen Erkrankungen, ist es leider auch schon zu Resistenzbildungen von Mikroorgansimen gegen viele dieser Wirkstoffe gekommen. Um die schweren Folgen einer post- antibiotischen Ära, in der vormals leicht zu behandelnde Infektionen durch z.B. kleine Verletzungen und Wunden wieder zum Tod führen können, da Therapiemöglichkeiten, aufgrund der mangelnden Zahl an Arzneistoffen, fehlen, zu verhindern, gilt es den Fokus der Forschung vermehrt auf das Ziel der Entdeckung neuer Antibiotika zu richten. Durch die hohe Wiederfindungsrate von bioaktiven Substanzen aus terrestrischen Quellen und der hohen Biodiversität im Meer, wurde die Erforschung mariner Lebensräume interessanter. Gleichzeitig stehen mehr, schnellere und günstigere Methoden zur Sequenzierung von Genomen zur Verfügung und die daraus resultierende stetig steigende Anzahl sequenzierter Genome, die Dank der wiederum verbesserten bioinformatischen Methoden präziser analysiert werden können, zeigen, dass ein enormes, meist verborgenes Potential, in Form von viel mehr biosynthetischen Genclustern in Chromosomen von Mikroorganismen, vorhanden ist, sie die darin kodierten Produkte aber unter normalen Kulturbedingungen wegen mangelnder umweltbedingter Reize nicht produzieren. Um dieses Potential auszuschöpfen und Gencluster zu aktivieren, von denen vermutet wird, dass sie für die Bildung von unbekannten Komponenten verantwortlich sind, können verschiedene Methoden angewendet werden. In dieser Diplomarbeit wurde das Ziel der Entdeckung neuer natürlicher Substanzen, mit Hilfe rekombinanter DNA Technologie und eines damit konstruiertem Reporter Systems, verfolgt. Es wurden drei Streptomyces Stämme verwendet, die aus drei verschiedenen Schwämmen des Trondheim Fjords in Norwegen isoliert wurden. Mit Hilfe der Software antiSMASH wurde das Genom dieser Aktinobakterien auf das Vorhandensein von biosynthetischen Genclustern untersucht und jene Cluster ausgewählt, die für die Bildung von eher unbekannten Sekundärmetaboliten verantwortlich sind. Um die Aktivität von vermutlichen Promotor Regionen in diesen Clustern zu ermitteln, wurden zuerst Primer entworfen und die entsprechenden Promotor Regionen unter Verwendung dieser Primer mittels PCR hergestellt. Nach dem Einbau dieser Promotoren in Plasmide, die ein ebenfalls eingebautes Reportergen namens bpsA, das für die Produktion von Indigoidin verantwortlich ist, enthielten, wurden diese Vektoren durch Konjugation von E. coli in die Streptomyces Stämme überführt und die Aktivität der Promotor Regionen aufgrund der Farbänderung des Fermentationsmediums durch Expression von bpsA beobachtet. 5 Die Verwendung von verschiedenen Nährmedien zur Fermentation und die Anwendung eines Ethanol- Schocks sollten die inaktiven Promotoren aktivieren und diese Aktivierung und die eventuell daraus folgende Bildung von Sekundärmetaboliten mittels Reporter nachgewiesen werden. Aus Kulturmedien mit einer Farbänderung wurden Extrakte hergestellt, die mittels HPLC und HPLC-MS analysiert und mit Hilfe von Wachstumshemmungstests auf Bioaktivität überprüft wurden.Plants, animals and microorganisms are a rich source of natural products, namely secondary metabolites. Some of these natural products can be used as drugs for the treatment of diseases, e.g. antibiotics for infections. The discovery of new anti-infectives is necessary due to the growing number of resistant pathogens. Despite a lack of medical treatments caused by a reduced number of available antibiotics, the list of newly discovered compounds that can be used for such purposes is short. One problem is frequent rediscovery of already known compounds. However, new approaches can be used to find unknown bioactive compounds using genomics, next to common screening methods. Bioinformatics-guided analysis of genome sequences of some bacteria revealed a vast potential for secondary metabolite production. In bacteria the genes for secondary metabolite biosynthesis are often physically clustered together. Under standard laboratory conditions most of these clusters remain silent, so it is necessary to activate them for the production of potentially new compounds. Genetic manipulations by molecular biological methods and the use of different fermentation media can force the production of putative new substances. In this work, marine actinomycetes from the genus Streptomyces, which represent a rich source for bioactive secondary metabolites were used to discover new natural products. The draft genome sequences of three different strains isolated from three different sponges from Norwegian fjord were analyzed by a bioinformatics tool called antiSMASH. Different biosynthetic gene clusters, which have, according to the in-silico analysis, a higher chance to produce an unknown compound, were chosen for this project. Putative promoter regions of the genes, which are responsible for the building of scaffold structures of secondary metabolites, were amplified by PCR. Those PCR products were introduced into plasmids upstream of the reporter gene bpsA, a NRPS encoding for indigoidine-synthase, responsible for production of a blue pigment indigoidine. After the introduction of those vectors in the Streptomyces strains by conjugation from Escherichia coli, fermentations in different media were performed. The observation of a color-change in the media used for fermentation, with and without ethanol shock, and compared to a control, indicated the activity of the promoter region and thus, the activation of the cluster. The latter may suggest the production of secondary metabolites, some of which are maybe previously undetected compounds. Fermentation cultures with a visible color difference, compared to a control, were extracted. The extracts were tested for bioactivity by growth inhibition assays. HPLC and HPLC-MS analysis resulted in known and putative new substances, which are interesting for further analyzation