Interference of adenosinergic sytem in endocannabinoid signalling at the hippocampus

Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2018Cannabis is the most consumed illicit drug worldwide but several currently commercialized drugs contain cannabinoid (CB) compounds and show beneficial treatments for many pathological conditions. However, the potential of these compounds is not completely clear, and how they affect brain function remains a questionable topic. It is known that CB act on the endocannabinoid system (eCB), a neuromodulatory system that exists throughout the brain affecting different brain functions. For the purpose of this work we focused on its effect on hippocampal network homeostasis, namely on its regulation of inhibitory synaptic tranmission. It is described that the eCB mediates several forms of synaptic plasticity, namely Depolarization-induced Supression of Inhibition (DSI) and inhibitory-Long Term Depression (i-LTD). These phenomena are caracheterized by a decrease in the neurotransmitter γ-Aminobutyric acid (GABA) release, for a short period with rapid recover in DSI, and a sustained decrease of GABAergic responses in i-LTD. These two synaptic plasticity processes share some common features: first there is a depolarization of the postsynaptic pyramidal cell that triggers eCB production; these lipid-soluble messengers travel retrogradelly to the presynaptic site, a GABAergic interneuron specifically from cholecystokinin (CCK) subpopulation; in the presynaptic terminal, eCB activate Cannabinoid Receptors type 1 (CBR1) that through blockade of Voltage Dependent Calcium Channels (VDCC) N-type, decrease the release of GABA. On the other hand, caffeine, the most consumed beverage in the world, antagonizes the adenosinergic system. This system is also a neuromodulatory system that regulates synaptic activity, being its two more relevant receptors Adenosine type-1 (A1) receptor and Adenosine-type A2A (A2A) receptor. A1 receptor is considered inhibitory since it inhibits cyclic Adenosine Monophosphate (cAMP) production through blockade of adenyl cyclase activity and neurotransmitter release rate. A2A receptor has the opposite role of A1 receptor, since it activates adenyl cyclase and increases release of neurotransmitter. These two adenosinergic receptors interplay in the synaptic neuronal function in order to balance homeostatic inhibition and excitation, in physiological conditions. Besides, adenosine is considered to be a metamodulator since it interferes with other neuromodulatory systems. An example is the eCB and the relation between the two has several examples described in the literature. Thus, the purpose of this work is to understand how DSI and i-LTD, two eCB-mediated synaptic plasticity phenomena are modulated by the adenosinergic system. This work was performed using patch-clamp technique on hippocampal slices. DSI and i-LTD were reproduced in the absence and in the presence of an antagonist of A1 receptor, 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX). Also, we evaluated if A1 and CB1 receptors shared a physical interaction, using co-immunoprecipitation assay (co-IP). The main findings of this work are that DPCPX decreases the magnitude of DSI and i-LTD effect, showing a crucial role of A1 receptor in their induction. Also, results of co-IP showed that A1 and CB1 form heteromers, and this relates with our hypothesis and previous results regarding a tight interaction between the adenosinergic and ecB system. Overall, these results may be the starting point to better understand how the adenosinergic system modulates the eCB system and how this affects hippocampal network when the homeostatic balance is disturbed.Cannabis é a droga ilícita mais consumida a nível mundial. Por outro lado, vários fármacos comercializados atualmente contêm compostos canabinóides (CB) que se têm mostrado como opções de tratamento benéficas para várias condições patológicas. No entanto, o potencial terapêutico destes compostos ainda não é completamente claro e o mecanismo pelo qual alteram a função cereberal permance tema de estudo. Está descrito na literatura que os CB atuam no sistema endocanabinóide (eCB), um sistema neuromodulador que existe em várias regiões cereberais e, portanto, afeta diferentes funções. Este trabalho focou-se nos efeitos na homeostasia da rede neuronal do hipocampo, uma região cereberal ligada à formação de memória e aprendizagem, e mais concretamente na regulação da plasticidade sinática na transmissão inibitória. Os eCB mediam várias formas de plasticidade sinática, nomeadamente Supressão da Inibção induzida por Despolarização (DSI) e Depressão a Longo Prazo inibitória (i-LTD). Estes fenómenos são caracterizados por uma diminuição na libertação do neurotransmissor ácido γ-aminobutírico (GABA), a curto prazo com uma rápida recuperação das respostas inbitórias, na DSI, e uma diminuição a longo prazo das respostas GABAérgicas, na i-LTD. Estes dois processos de plasticidade sinática partilham aspetos mecanísticos comuns. Em primeiro lugar, ocorre uma despolarização na célula piramidal pós sinática que leva à produção de eCB; estes mensageiros lipido-solúveis viajam de forma retrógada até ao terminal pré-sinático, um interneurónio GABAégico especificamente da subpopulação colecistocinina (CCK); no terminal pré-sinático, os eCB ativam receptores de Canabinóides tipo 1 (CBR1), os quais, através do bloqueio de Canais de Cálcio Dependentes da Voltagem (VDCC) tipo-N, diminuem a libertação de GABA. Por outro lado, a cafeína, a bebida mais consumida a nível mundial, antagoniza o sistema adenosinérgico. Este é também um sistema neuromodulador que modula a transmissão e plasticidade sinática, sendo que os recetores mais relevantes são o receptor da Adenosina tipo 1 (A1) e o recetor da Adenosina tipo 2 (A2A). O recetor A1 é considerado inibitório já que inibe a produção de adenosina monofosfato cíclica (cAMP) através do bloqueio da atividade da Adenil ciclase. O recetor A2A tem ações opostas às do A1 já que ativa a Adenil cliclase e aumenta a libertação de neurotransmissor. Estes dois recetores adenosinérgicos interatuam na função sinática no sentido de manter um equilíbrio homeostático entre inibição e excitação neuronal, em condições fisiológicas. Para além disso, o sistema adenosinérgico é considerado um metamodulador já que interfere com outros sistemas neuromoduladores. Um exemplo é com o sistema eCB, cuja relação apresenta vários exemplos descritos na literatura. Assim, o objetivo deste trabalho é perceber como é que a DSI e a i-LTD, dois fenómenos de plasticidade sinática mediados por eCB, são modulados pelo sistema adenosinérgico. Para isso, foram realizados registos de eletrofisiologia através da técnica de patch-clamp em fatias hipocampais. A DSI e a i-LTD foram reproduzidas na ausência e na presença de um antagonista dos recetores A1, 8-ciclopentil-1.2-dipropilxantina (DPCPX). Para além disso, foi avaliada a interação física dos recetores A1 e CB1, através da técnica de co-imunoprecipitação (co-IP). Os principais resultados deste projeto mostram que o DPCPX diminui a magnitude dos efeitos da DSI e i-LTD, mostrando assim o papel crucial dos recetores A1 na indução destes fenómenos. Além disso, os resultados da co-IP mostram que os recetores A1 e os CB1 formam heterómeros, apresentando coerência com a nossa hipótese e resultados anteriores que descrevem uma interação estreita entre o sistema adenosinérgico e o eCB. No geral, estes resultados são um ponto de partida para compreender melhor como é que o sistema adenosinérgico modula o sistema eCB, e como é que isto afeta a rede neuronal hipocampal quando o equilíbrio homeostático é perturbado