Avaliação da utilização do reagente Casework direct na análise genética de rotina de amostras forenses

Relatório de Estágio do Mestrado em Engenharia Biológica e QuímicaEste trabalho foi desenvolvido nas instalações da Polícia Judiciária, concretamente nos laboratórios da área de biotoxicologia, tendo como objetivo avaliar o uso de um reagente específico de extração de DNA em diferentes tipos de amostras, para a obtenção de perfis genéticos, e em particular, efetuar a comparação do uso de dois métodos diferentes de quantificação de modo a perceber se algum se adequava melhor a este método de extração. O trabalho desenvolvido baseou-se na recolha de amostras de diversos tipos tais como sangue, cabelos, sémen, saliva, entre outras, cujo DNA foi extraído com o kit Casework Direct. Em seguida, estes extratos foram quantificados com dois kits, o PowerQuant® e o Quantifiler® Trio. O kit PowerQuant® funcionou, em geral, melhor com o método do Casework Direct, tendo apresentado muito menos inibições (em particular, quando extraídas de amostras de sangue) e conseguido quantificar valores mais baixos de DNA (~10-5 ng/μl) que o Quantifiler® Trio, mostrando assim uma maior sensibilidade (numa ordem de grandeza de diferença). Em amostras mais concentradas e sem efeitos inibitórios, o uso de qualquer um dos kits revelou-se estatísticamente semelhante, observando-se uma correlação significativa entre os resultados para cada amostra (num nível de confiança de 95%). Concluiu-se que a maior fonte de inibições era detetada em amostras provenientes de sangue, e em particular se recolhidas diretamente de tecido e não com zaragatoa. O método de extração de DNA revelou-se desadequado para a análise de amostras de osso. Efetuou-se a análise genética forense de todas as amostras, por amplificação do DNA com o kit Global Filer e determinação dos perfis por eletroforese capilar. Obtiveram-se resultados satisfatórios e condizentes com a quantificação, tendo-se obtido, de um total de 108 amostras, 58 amostras com perfil completo, 43 amostras sem perfil e 7 amostras com perfil degradado. Foram considerados completos os perfis que, por lei, podem entrar na base de dados portuguesa. Efetuou-se ainda uma validação final dos resultados, com a análise do grau de parentesco, usando um par de amostras de origem conhecida. Estes resultados demonstraram a adequação do método de extração usado, e da subsquente quantificação a análises genéticas forenses.This work was developed in the facilities of the Polícia Judiciária, specifically in the biotoxicology laboratories, with the objective of evaluating the use of a specific DNA extraction reagent in different types of samples, in order to obtain genetic profiles, and in particular, to perform the comparison of the use of two different methods of quantification in order to perceive if some one was better adapted to this method of extraction. The work was based on the collection of samples of various types such as blood, hair, semen, saliva, among others, whose DNA was extracted with the Casework Direct kit. These extracts were then quantified with two kits, PowerQuant® and Quantifiler® Trio. The PowerQuant® kit generally worked better with the Casework Direct method, and showed much less inhibition (particularly when extracted from blood samples) and was able to quantify lower values of DNA (~ 10-5 ng / μl) than the Quantifiler® Trio, thus showing greater sensitivity (in an order of magnitude difference). In more concentrated and non-inhibitory samples, the use of either kit was statistically similar, with a significant correlation between the results for each sample (at a 95% confidence level). It was concluded that the major source of inhibition was detected in samples from blood, and in particular if collected directly from tissue and not from swab. The method of DNA extraction proved to be unsuitable for the analysis of bone samples. Forensic genetic analysis of all samples was carried out by DNA amplification with the Global Filer kit and determination of the profiles by capillary electrophoresis. Results were satisfactory and consistent with quantification. A total of 108 samples were obtained, 58 samples with complete profile, 43 samples without profile and 7 samples with degraded profile. Profiles that, by law, can be entered in the Portuguese database were considered complete. A final validation of the results was carried out, with the analysis of the degree of kinship, using a pair of samples of known origin. These results demonstrated the adequacy of the extraction method used, and the subsequent quantification for forensic genetic analysis