Terapia gênica ex vivo e in vivo em modelo murino de mucopolissacaridose do tipo I : potencialidade de vetores retrovirais aplicados pela via intraventricular

A mucopolissacaridose tipo I (MPSI) é uma doença monogênica autossômica recessiva, devido a mutações no gene da alfa-L-iduronidase (IDUA). Seu caráter sindrômico compromete todas as funções vitais do organismo, inclusive a neurocognição. Atualmente, como formas disponíveis de tratamento existem apenas os transplantes de medula óssea/célula tronco hematopoiética e a reposição enzimática (RE). Os transplantes dependem da disponibilidade dos doadores e da idade em que o diagnóstico é comprovado. A RE é um procedimento semanal e contínuo por toda a vida do paciente, invasivo e de alto custo. Esse melhora consideravelmente as doenças visceral e articular/óssea; contudo, não apresenta o mesmo efeito sobre a neuropatologia, principalmente na fase mais avançada. No presente trabalho, células-tronco mesenquimais transduzidas com o vetor MLV contendo o transgene IDUA foram injetadas intraventricularmente no cérebro de camundongos MPSI adultos de duas faixas etárias (12 e 25 semanas). O estudo foi concluído quando os animais atingiram 20 e 29 semanas, respectivamente. Essa metodologia resultou na diminuição dos níveis de GAGs acumulados no cérebro dos animais afetados. Tendência de melhora locomotora foi detectada, através de teste de campo aberto de exposição única, mesmo nos animais tratados em fase mais avançada da neuropatologia. A queda de expressão do transgene, observada com frequência neste tipo de abordagem, pode ter sido um entrave para que a correção cruzada (cross correction) fosse mais duradoura. Baseando-se nessa experiência, nós desenvolvemos um novo vetor retroviral (MSCV IDUA) para ser avaliado in vitro com ferramenta de transferência gênica para células-tronco mesenquimais. Esse vetor promoveu expressão sustentável do transgene e rapidez de seleção das células geneticamente modificadas, via resistência à blasticidina. A administração in vivo desse vetor, através de injeção intraventricular bilateral no cérebro de camundongos MPSI jovens, levou à produção local de níveis detectáveis de IDUA ao término do experimento (30 dias). Esse estudo in vivo de terapia gênica (TG) para mucopolissacaridose do tipo I murina também avaliou a potencialidade de outros dois vetores virais (HIV e MLV), nessas mesmas condições experimentais. O vetor baseado em HIV também foi capaz de promover a expressão in situ da enzima, enquanto que o MLV não. Redução no conteúdo total de GAGs extraídos do cérebro dos animais foi detectada apenas para os grupos tratados com os vetores MSCV e HIV. Intensa redução na proporção de dermatan/heparan sulfato nessas amostras também foi detectada. Concluindo, o vetor MSCV mostrou-se uma boa ferramenta de transferência gênica in vitro e in vivo, favorecendo a produção in situ da enzima de forma sustentável, o que é altamente desejável na realização de TG in vivo. Devido à possibilidade de seleção rápida das células geneticamente modificadas após a transdução com esse vetor, a realização de um novo protocolo pré clínico de TG ex vivo baseada em células-tronco mesenquimais oriundas desse modelo murino de MPSI também poderá ser beneficiada.Mucopolysaccharidosis type I (MPSI) is an autosomal recessive disease due to mutations in the alpha-L-iduronidase gene (IDUA). MPSI is a multisystemic disorder, in which all vital functions are compromised, including neurocognition. Currently, the only two options of treatment available are bone marrow/hematopoetic stem cell transplantation and enzyme replacement therapy (ERT). Transplantations depend on availability of compatible donors and the age at diagnosis. ER is a weekly and life-time procedure, invasive and a high cost treatment. It ameliorates visceral and joint/bone diseases, however, the same effect on neuropathology is not achieved, mainly in most advanced stages of the disease. Mesenchymal stem cells transduced with MLV vector containing the IDUA transgene were injected intraventricularly in the brain of MPSI adult mice (12 and 25 weeks). The study was concluded when animals were 20 and 29 weeks old, respectively. This protocol resulted in a reduction of GAGs accumulated in the brain. Locomotion improvement was observed through open field analysis, even in animals treated at advanced stages of neuropathology. The decrease of transgene expression, which is frequently observed in this type of approach, may have restrained the mechanism of cross-correction. Based on that, we developed a new retroviral vector (MSCV IDUA) to be analyzed in vitro as a gene transfer tool to mesenchymal stem cells. This vector demonstrated a sustainable expression of the transgene and enabled a fast selection of genetically modified cells through blasticidin resistance. In vivo administration of the vector, through bilateral intraventricular injection in the brain of young MPSI mice, led to the production of detectable local levels of IDUA 30 days after the procedure. This in vivo study of gene therapy for murine MPSI also evaluated the potentiality of two other viral vectors (HIV and MLV), at the same experimental conditions. HIV based vector was also able to induce in situ production of the enzyme, whilst MLV was not. A reduction of total GAGs extracted from mice brains was detected only in the groups treated with MSCV and HIV, as well as an intense reduction of dermatan/heparan sulfate proportion. Therefore, MSCV vector was shown to be an efficient gene transfer tool in vitro and in vivo, enabling in situ sustainable production of the enzyme, which is highly desirable for in vivo gene therapy. Due to the possibility of fast selection of genetically modified cells after transduction with this vector, the accomplishment of a new ex vivo pre clinical gene therapy protocol based on mesenchymal stem cells from the murine model of MPSI may also be benefited