Desenvolvimento de nanopartícula com β-ciclodextrina e avaliação de seu potencial terapêutico para tratamento da Doença de Niemann-Pick C

As doenças lisossômicas de depósito (DLDs) compreendem cerca de 70 desordens genéticas ocasionadas por mutações em proteínas críticas para o funcionamento dos lisossomos. Apesar de serem consideradas raras quando isoladas, as DLDs afetam coletivamente 1 a cada 5.000 nascidos vivos, tornando-as significativas doenças metabólicas da infância. Dentre as DLDs, encontra-se a doença de Niemann-Pick C (NPC), a qual é caracterizada por um engarrafamento lipídico intracelular ocasionado pela mutação nos genes NPC1 ou NPC2 e consequente acúmulo de colesterol e glicoesfingolipídios dentro do compartimento endossomal/lisossomal das células. A NPC apresenta, assim como a maioria das DLDs, envolvimento neurológico. Ainda não existe cura para NPC, mas inúmeros estudos vêm demonstrando a utilização benéfica da - -CD) devido à sua capacidade de mobilizar o colesterol acumulado dos lisossomos para a corrente sanguínea. Entretanto, a principal -CD é a sua incapacidade em atravessar a barreira hemato-encefálica (BHE). A procura por novos sistemas de liberação de fármacos tem sido muito relevante no sentido de se estabelecerem alternativas terapêuticas mais eficientes, que possibilitem administrar os fármacos com maior segurança, com efeitos colaterais minimizados e nos locais de ação específicos. Nesse sentido, a estrutura tridimensional flexível torna as nanopartículas lipídicas (fases esponja e microemulsões) formadas por monoleína excelentes candidatas ao carreamento de fármacos e enzimas. No desenvolvimento de carreadores nanométricos direcionados ao sistema nervoso central (SNC), o polissorbato 80 vem demonstrando ser o tensoativo mais indicado. Considerando o exposto, o objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de uma nanopartícula-plataforma, capaz de atravessar a BHE e liberar enzimas/fármacos dentro dos lisossomos. Além disso, utilizando a plataforma como ponto de partida, objetivou- -CD e assim o desenvolvimento de uma nanopartícula para o tratamento da NPC. Por fim, buscou-se avaliar o potencial citotóxico das nanopartículas previamente desenvolvidas. As nanopartículas foram caracterizadas por espalhamento dinâmico de luz (DLS), espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS) e 11 por criomicroscopia eletrônica de transmissão (cryo-MET). As nanopartículas consideradas como plataformas (NS) apresentaram diâmetro médio de cerca -CD apresentaram (NS -CD) diâmetro médio de cerca de 120 nm. Os perfis de espalhamento obtidos por SAXS para ambas nanopartículas desenvolvidas ajustaram-se ao modelo matemático de Teubner-Strey, aplicado com sucesso para descrever microemulsões e fases esponja. Os resultados de cryo-TEM corroboraram os resultados de SAXS e DLS, demonstrando a presença de estruturas com fase interna bicontínua desordenada com tamanho médio próximo a 100 nm. Através da utilização de cumarina-6 foi possível determinar que as NS e NS -CD atingiram os lisossomos após 1 hora de incubação na cultura celular. As nanopartículas foram rastreadas in vivo e se mostraram capazes de atingir o tecido cerebral, conferindo grande vantagem em relação às terapias comumente utilizadas. As nanopartículas foram capazes, também, de atingir o tecido hepático, que está amplamente comprometido em doenças como a NPC. Além disso, a NS -CD mostrou atividade em reduzir os níveis de colesterol acumulado em fibroblastos dérmicos derivados de pacientes NPC. Tanto NS, quanto NS -CD não causaram hemólise, um pré-requisito para administração parenteral, não apresentaram citotoxicidade e genotoxiciddade. Além disso, não causaram perturbações oxidativas/nitrativas quando incubadas com fibroblastos de pacientes NPC. As nanopartículas desenvolvidas neste projeto apresentaram resultados bastante promissores quanto à sua utilização para o tratamento de DLDs e, em particular, de NPC.Lysosomal storage diseases (LSDs) comprise about 70 genetic disorders caused by mutations in critical proteins to lysosomes functioning. Although they are considered rare when isolated, LSDs collectively affect 1 in 5,000 live births, making them significant childhood metabolic diseases. Among the LSDs is Niemann-Pick type C (NPC) disease, which is characterized by intracellular lipid impairment caused by mutation in NPC1 or NPC2 genes and consequent accumulation of cholesterol and glycosphingolipids inside the endosomal/lysosomal cell compartment. NPC presents neurological impairment, as most LSDs. There is still no cure for NPC, but several studies have demonstrated the beneficial use of -cyclodextrin ( -CD) because of its ability to mobilize accumulated cholesterol from lysosomes into the bloodstream. However, the main disadvantage presented by free -CD is the inability to cross the blood-brain barrier (BBB). The search for new drug delivery systems has been very relevant in order to establish more efficient therapeutic alternatives, that allow to administer drugs with greater security, minimized side effects and in the specific sites of action. In this sense, the flexible threedimensional structure makes the lipidic nanoparticles (sponge phases and microemulsions) formed by monoolein excellent candidates for the transport of drugs and enzymes. In the development of nanometric carriers directed to the central nervous system (CNS), polysorbate 80 has been shown to be the most indicated surfactant. Considering the above, the objective of this work was the development of a nanoparticle-platform, able to cross the BBB and release drugs/enzymes into the lysosomes. In addition, using the platform as a starting point, the objective was to incorporate -CD in a nanoparticle for NPC treatment. Finally, we aimed to evaluate the cytotoxic potential of previously developed nanoparticles. The nanoparticles were characterized by dynamic light scattering (DLS), small angle X ray scattering (SAXS) and by cryogenic transmission electron microscopy (cryo-TEM). The nanoparticles considered as platforms (NS) had an average diameter of about 115 nm, whereas nanoparticles containing -CD (NS -CD) had a mean diameter of about 120 nm. The scattering profiles obtained by SAXS for both nanoparticles were adjusted 13 to the Teubner-Strey mathematical model, successfully applied to describe microemulsions and sponge phases. The cryo-TEM results corroborated the results of SAXS and DLS, demonstrating the presence of structures with a disordered bicontinuous inner phase and with an average size close to 100 nm. By using coumarin-6 it was possible to track NS and NS -CD into cells, and results showed that the NS reached the lysosomes after 1 hour of incubation with healthy fibroblasts, and NS -CD remain in NPC fibroblasts for at least 3 hours. The nanoparticles were tracked in vivo and reached the brain tissue, which confers great advantage over the commonly used therapies. The nanoparticles were also able to target hepatic tissue, which is extensively involved in diseases such as NPC. In addition, NS -CD induced a decrease in cholesterol accumulation when incubated with dermal NPC fibroblasts patientsderived. Both NS and NS -CD did not cause hemolysis, a pre-requisite for parenteral administration, did not show cytotoxicity and genotoxicity. In addition, they did not cause oxidative/nitrative disturbances when incubated with fibroblasts from NPC patients. The nanoparticles developed in this project presented very promising results regarding their use for the treatment of LSDs, in particular NPC