Evaluation of the effect of cell therapy with osteoblasts on bone tissue regeneration

Apesar do grande potencial de regeneração do tecido ósseo, em algumas situações a extensão da lesão impede que o tecido se repare completamente. Como uma alternativa em relação aos tratamentos convencionais, a terapia celular tem sido considerada como promissora para o reparo de defeitos ósseos. No entanto, poucos estudos investigaram a terapia celular utilizando osteoblastos, portanto, avaliamos o efeito da injeção direta de osteoblastos na regeneração do tecido ósseo. Como os osteoblastos têm origens embrionárias diferentes, foi comparado in vitro o potencial osteogênico de osteoblastos derivados da crista neural, do mesoderma e de ambas as origens embrionárias. Considerando a necessidade de grande número de células para a terapia, foi comparado o efeito de uma subcultura, como meio de aumentar a quantidade de células, no potencial osteogênico dos osteoblastos. Para avaliação da regeneração dos defeitos, osteoblastos foram injetados diretamente nesses defeitos. Osteoblastos foram obtidos da calvária de ratos recém-nascidos (Wistar), sendo que os derivados da crista neural foram isolados dos ossos frontais (OB-CN); os do mesoderma isolados dos ossos parietais (OB-MS); e de ambas as origens embrionárias isolados de toda a calvária (OB-Cal). O efeito da subcultura no potencial osteogênico foi avaliado em OB-Cal ou na primeira passagem dessa cultura (OB-Cal P1). Após até 14 dias em cultura, foram avaliadas a proliferação celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP), formação de matriz extracelular mineralizada e a expressão dos genes marcadores osteoblásticos: fator de transcrição runt-related 2 (RUNX2), ALP, osteocalcina (OC) e sialoproteína óssea (BSP). Para avaliar a regeneração do tecido ósseo, foram criados defeitos de 5 mm de diâmetro na calvária de ratos Wistar, que após 2 semanas foram tratados com 5 x 106 osteoblastos derivados de OB-Cal P1, por meio de injeção local. Ao final de 4 semanas, a formação óssea foi avaliada por microtomografia computadorizada e análise histológica. Os dados foram comparados por ANOVA, seguido do teste de Student-Newman-Keuls, ou teste t, quando apropriado, considerando o nível de significância de 5%. A comparação do potencial osteogênico em relação à origem embrionária mostrou que, os OB-MS apresentaram maior proliferação mas não houve diferença entre as culturas no evento final da diferenciação osteoblástica, que é a formação de matriz mineralizada. No entanto, como as culturas de OB-Cal apresentaram maior expressão gênica de marcadores iniciais, intermediários e finais dessa diferenciação; e considerando que, essas culturas são aquelas nas quais é possível obter o maior número de células, optamos por utilizar essas culturas na avaliação da formação óssea induzida pela terapia celular. Além disso, os resultados mostraram que os OB-Cal P1 tem seu potencial osteogênico reduzido, mas considerando que a subcultura permite a obtenção de maior número de células, são uma boa escolha para a terapia celular. Tanto que, ao avaliar in vivo a capacidade regenerativa das OBCal P1 no reparo dos defeitos ósseos, as análises microtomográficas e histológicas mostraram que que a terapia celular com injeção local de osteoblastos obtidos de fragmentos ósseos da calvária constitui uma estratégia adequada para estimular o reparo ósseoDespite of the great potential of regeneration of the bone tissue, in some situations the extension of the lesion prevents the tissue from repairing completely. As an alternative to conventional treatments, cell therapy has been considered a promising strategy for the repair of bone defects. However, few studies investigated cell therapy using osteoblasts, therefore, we evaluated the effect of direct injection of osteoblasts on the regeneration of bone tissue. Since osteoblasts have different embryonic origins, the osteogenic potential of osteoblasts derived from neural crest, mesoderm and both embryonic origins was compared in vitro. Considering the need for a large number of cells for the therapy, the effect of a subculture, a common way to increase the amount of cells, on the osteogenic potential was also compared. Then, osteoblasts were injected directly into bone defects to evaluate the regeneration of bone tissue. Osteoblasts were obtained from the calvaria of newborn rats (Wistar), the neural crest derivatives were isolated from the frontal bones (OB-CN); those of the mesoderm isolated from the parietal bones (OB-MS); and from both embryonic origins isolated from the entire calvaria (OB-Cal). The effect of the subculture on the osteogenic potential was evaluated in OB-Cal and in its firstpassage (OB-Cal P1). After up to 14 days, all cultures were assayed for cell proliferation, alkaline phosphatase activity (ALP), mineralized extracellular matrix formation and the expression of the osteoblastic marker genes: runtrelated transcription factor 2 (RUNX2), ALP, osteocalcin (OC) and bone sialoprotein (BSP). To evaluate the effect of cell injection on bone regeneration, defects of 5 mm diameter were created in the calvaria of Wistar rats, that after 2 weeks were injected with 5 x 106 OB-Cal P1-derived osteoblasts. Vehicle injections were used as control. At the end of 4 weeks, the bone formation was evaluated by computerized microtomography and histological analysis. Data were compared by ANOVA, followed by the Student-Newman-Keuls test, or ttest, when appropriate, and the level of significance was set at 5%. The comparison of the osteogenic potential related to the embryonic origin showed that the OB-MS presented a greater proliferation but there was no difference between the cultures in the final event of the osteoblastic differentiation, that is the formation of mineralized matrix. However, as OB-Cal cultures showed greater gene expression of initial, intermediate and final markers of this differentiation; and considering that these cultures are those in which it is possible to obtain the largest number of cells, we selected these cultures for evaluating the bone formation induced by the cell therapy. In addition, the results showed that OB-Cal P1 still holds its osteogenic potential and despite being lower than that of OB-Cal as the subculture allows obtaining more cells, it has been considered as a good choice for cell therapy. In agreement with this, OB-Cal P1-derived osteoblasts injected into the bone defects were capable of inducing more bone formation than control, as revealed by microtomographic and histological analyzes. Therefore, it supports the idea that cell therapy with local injection of osteoblasts obtained from calvarial bone fragments is an adequate strategy to stimulate bone formatio