Regulation of aromatase expression by CTBP1 and steroid hormones in prostate cancer associated to metabolic syndrome

El cáncer de próstata (CaP) continúa siendo uno de los cánceres más comunes en hombres en todo el mundo. Los factores de riesgo establecidos para esta enfermedad son la edad, la raza y la historia familiar; sin embargo la dieta y el estilo de vida son factores claves en la biología y tumorigénesis del CaP. El síndrome metabólico (SM) es un desorden fisiopatológico que se caracteriza por un conjunto de factores de riesgo metabólico entre los cuales se encuentran la obesidadabdominal, la dislipidemia aterogénica, la hipertensión, la resistencia a la insulina, laintolerancia a la glucosa, un estado protrombótico y un estado proinflamatoriocrónico. En los últimos años el papel del SM en la incidencia y progresión del CaP hasido controversial; sin embargo, recientemente un meta-análisis reveló que el SM estáasociado con un peor pronóstico, un aumento de la agresividad tumoral y una mayortasa de recurrencia de los pacientes con CaP. Trabajos de nuestro grupo acerca de C-terminal binding protein 1 (CTBP1) mostraron una posible explicación molecular para estas asociaciones. CTBP1 es un co-represor transcripcional de genes supresores tumorales que es activado por una relación NAD+/NADH baja. Previamente, utilizando distintos modelos animales de SM pudimos determinar que el silenciamiento de la expresión de CTBP1 en xenotransplantes disminuyó drásticamente el crecimiento tumoral de mama y de próstata. Asimismo, a partir de microarreglos obtuvimos el perfil de expresión de mRNA de los xenotransplantes de próstata. Un análisis de GSEA (gene set enrichment analysis) nos permitió determinar que CTBP1 modula la expresión de genes relacionados con la biosíntesis de hormonas esteroideas y metabolismo, entre los cuales se encuentra la enzima aromatasa (CYP19A1). La aromatasa es una proteína clave que determina la relación andrógenos/estrógenos en la próstata normal y en el CaP. Este equilibrio de andrógenos y estrógenos es crítico para el funcionamiento normal de la próstata y en consecuencia cualquier alteración en la expresión de aromatasa tiene el potencial de cambiar este equilibrio y ejercer efectos profundos a través de ER-α, ER-β y/o efectos no mediados por estos receptores. Si bien los estrógenos han sido implicados en la etiología del CaP, los mecanismos específicos que subyacen a este papel aún no han sido dilucidados.Por otro lado, el tejido adiposo (AT) es un órgano con gran actividad endócrina ymetabólica que puede afectar el desarrollo y la progresión del CaP. En hombres, el ATblanco (WAT) es el principal sitio de síntesis de estrógenos a partir de andrógenos através de la enzima aromatasa localizada en los adipocitos. El incremento deadiposidad causado por el SM se asocia con un aumento en la actividad de aromatasay en los niveles de estrógenos libres circulantes, con la consecuente disminución en losniveles de testosterona libre. Por lo tanto, el aumento de estrógenos en un contextode SM podría ser responsable de tumores de próstata más agresivos.Asimismo, los microRNAs (miRNAs) son moléculas pequeñas de RNA no-codificantesque tienen un rol crucial como reguladores de la expresión génica. Cada miRNA tienecomo blanco múltiples mRNAs, por lo cual la modulación de un mismo miRNA puedealterar importantes procesos. Además, estas moléculas son prometedoras para serusadas como biomarcadores diagnósticos y pronósticos así como blancos y/o agentesterapéuticos.En base a estos antecedentes el objetivo general de este trabajo fue investigar el roldel eje Estradiol/CYP19A1/CTBP1/miRNAs en el desarrollo del CaP para identificarnuevos candidatos moleculares que puedan ser utilizados en el futuro comobiomarcadores para mejorar el diagnóstico, pronóstico y/o la respuesta a la terapia enun subgrupo de pacientes con CaP y SM.En este trabajo de tesis en primer lugar validamos el resultado del microarreglo deexpresión de mRNA y observamos que CTBP1 modula la expresión desulfurotransferasas, deshidrogenasas y citrocromo P450 oxidasas en xenotransplantesde próstata desarrollados en animales con SM. Más aún, CTBP1 reprime la expresiónde CYP19A1. A su vez, determinamos que CTBP1 interacciona físicamente con elpromotor de CYP19A1 reprimiendo su transcripción en líneas celulares de CaP.Utilizando un panel de plásmidos reporteros que tienen clonado distintas longitudesde los promotores I.4 y PII de CYP19A1 río arriba del gen de la luciferasa, pudimosdeterminar que CTBP1 es capaz de modular los dos promotores de CYP19A1independientemente del largo del promotor presente. Más aún, utilizando un panel defactores y co-reguladores de la transcripción, encontramos que CTBP1 y EP300 se unen a los promotores I.4 y PII de aromatasa y reprimen sinérgicamente su transcripción. A su vez, el estradiol, a través de ER-β, produce la liberación de CTBP1 del promotor de CYP19A1 aumentando su expresión en células de CaP insensibles a andrógenos. Además, el silenciamiento de CTBP1 en xenotransplantes de CaP insensibles a andrógenos en un contexto de SM induce la expresión y actividad de CYP19A1 aumentando la concentración de estradiol intratumoral.Estudiando el rol de los estrógenos en el CaP, encontramos que el estradiol induce laviabilidad y la progresión del ciclo de células de CaP sensibles a andrógenos, mientrasque disminuye la viabilidad de líneas celulares insensibles a andrógenos.Además, generamos un modelo murino no inmunodeficiente de SM y CaP utilizandoratones machos C57BL/6J y células murinas de CaP TRAMP-C1. Este modelo nospermitió determinar que el SM aumenta el crecimiento tumoral de alotransplantesmurinos de próstata sensibles a andrógenos y estrógenos y los niveles de estradiolsérico en ratones, lo cual respalda la idea de que el incremento de los niveles deestradiol séricos en un contexto de SM afecta el desarrollo del CaP. Más aún,encontramos que los ratones con SM mostraron una mayor cantidad de AT, hipertrofiade adipocitos, mayor densidad de crown like structures (CLS), e inducción de laexpresión de genes y miRNAs que regulan la inflamación y la adipogénesis, lo cual lleva a un fenotipo proinflamatorio, una característica importante del SM. Por otro lado,también pudimos determinar que el SM induce un perfil de expresión de genes ymiRNAs aberrante en los tumores que podría ser crítico en el desarrollo tumoralprostático. Más importante aún, describimos por primera vez que la expresión deCTBP1 endógena fue activada por el SM en tumores prostáticos. Estos resultadosvalidan nuestra hipótesis que propone a CTBP1 como una proteína que conecta elcrecimiento del CaP y el SM. De la misma forma, el WAT de ratones con SM indujo la proliferación, y la expresión de oncogenes y oncomiRs en células TRAMP-C1 en co-cultivos. Finalmente, aislamos miRNAs del medio del co-cultivo y realizamos un microarreglo de expresión de miRNAs. Luego del análisis obtuvimos 49 miRNAs liberados al medio de cultivo por la interacción entre WAT-SM/células tumorales en comparación WAT-sin SM/células tumorales.Por lo tanto, estos resultados describen por primera vez un nuevo ejeEstradiol/CYP19A1/CTBP1/miRNAs que explica, en parte, el mecanismo por el cual elSM aumenta el crecimiento tumoral prostático.Prostate cancer (PCa) continues to be one of the most common cancers in men worldwide. The established risk factors for this disease are age, race and family history; however diet and lifestyle are key factors in PCa biology and tumorigenesis. Metabolic syndrome (MeS) is a physiopathological disorder that comprises, at least, three of the following factors: abdominal obesity, atherogenic dyslipidemia, hypertension, insulin resistance, glucose intolerance and prothrombotic and proinflammatory state. The role of MeS in PCa incidence and progression has been controversial; however, recently a meta-analysis revealed that MeS is linked to poor prognosis in PCa patients, increased tumor aggressiveness and biochemical recurrence. Previously, our group identified C-terminal binding protein 1 (CTBP1) as a molecular link associating PCa and MeS. CTBP1 is a transcriptional co-repressor of tumor suppressor genes that is activated by a low NAD+/ NADH ratio. Previously, using different animal models of MeS we found that CTBP1 depletion in xenografts dramatically decreased PCa and breast cancer growth. Also, using microarrays we obtained the mRNA expression profile of prostate xenografts. A GSEA (gene set enrichment analysis) allowed us to identify that CTBP1 modulates hormone biosynthesis and metabolism-related genes, including the aromatase enzyme (CYP19A1) that is involved in the estradiol synthesis by conversion from testosterone. Aromatase is a key protein that regulates androgens/estrogens ratio in the normal prostate and in PCa. This balance of androgens/estrogens is critical for the normal functioning of the prostate gland and consequently alteration in aromatase expression has the potential to change this balance and exert profound effects through ER-α, ER-β and/or effects not mediated by these receptors. Although estrogens have been implicated in PCa etiology, the mechanisms underlying this role have not yet been elucidated. Adipose tissue (AT) is an endocrine active organ that contributes to PCa development and progression. In men, white AT (WAT) is the main site of endogenous estrogen synthesis from androgens by the aromatase enzyme located in adipocytes. Adiposity deposit caused by MeS is associated to an increase in aromatase activity and in free circulating estrogen levels, and a decrease in free testosterone levels. Therefore, the increase in estrogen levels in a MeS context could be responsible for more aggressive prostate tumors. microRNAs (miRNAs) are small non-coding RNA molecules that play a crucial role as gene expression regulators. Each miRNA targets multiple mRNAs, so modulation of one miRNA can modify important processes. Also, these molecules are promising to be used as diagnostic and prognostic biomarkers as well as targets and/or therapeutic agents. Based on this background, the aim of this work was to investigate the role of the Estradiol/CYP19A1/CTBP1/miRNAs axis in PCa development to identify new molecular candidates that may be used in the future as biomarkers to improve diagnosis, prognosis and/or response to therapy in a subgroup of patients with PCa and MeS. In this thesis we first validated the result of the mRNA expression microarray and found that CTBP1 modulates the expression of sulfurotransferases, dehydrogenases and citrochrome P450 oxidases in prostate xenografts developed in MeS mice. Furthermore, CTBP1 suppresses the expression of CYP19A1. In turn, we determined that CTBP1 directly bind to CYP19A1 promoter and downregulates its transcription in PCa cells lines. Also, using a panel of reporter constructs, containing different lengths of CYP19A1 promoter regions upstream of the luciferase gene, we were able to determine that CTBP1 repressed the activity of all the different CYP19A1 promoters. Furthermore, using a panel of transcription factors and co-regulators, we found that CTBP1 and EP300 bound to I.4 and PII aromatase promoters and synergistically repress their transcription. In turn, estradiol, through ER-β, releases CTBP1 protein from CYP19A1 promoters, increasing its expression in androgen insensitive PCa cells. In addition, CTBP1 depletion in androgen insensitive PCa xenografts in MeS mice induces CYP19A1 expression and activity increasing intratumoral estradiol concentration. Studying the rol of estrogens in PCa, we found that estradiol induces the viability and cell cycle progression of androgen sensitive PCa cells, while decreases the viability of androgen insensitive cell lines. In addition, we generated a non-immunodeficient murine model of MeS and PCa using C57BL/6J male mice and murine PCa TRAMP-C1 cells. This model allowed us to determine that MeS increases tumor growth of murine prostate transplants sensitive to androgens and estrogens and serum estradiol levels in mice, supporting the idea that the increase in serum estradiol levels in a MeS context affects PCa development. Furthermore, we found that MeS mice showed an increased amount of AT, adipocyte hypertrophy, high crown like structures (CLS) density, adipogenesis and inflammation genes and miRNAs expression induction, compared to control animals, which indicates chronic AT inflammation, an important feature of MeS. Additionally, we described that MeS induces an aberrant gene and miRNAs expression profile critical for prostate tumor development. More important, we described for the first time that endogen Ctbp1 was transcriptional activated by MeS in prostate tumors. These results validated our hypothesis showing CTBP1 as a molecular link that associates MeS and PCa growth. Moreover, co-cultures determined that WAT from MeS mice induces proliferation, oncogenes and oncomiRs expression in TRAMP-C1 cells. Finally, we isolated miRNAs from the co-culture medium and performed a miRNA expression microarray. After the analysis we obtained 49 miRNAs released into the culture medium by the interaction between WAT-MeS mice/tumor cells compared to WAT-control mice/tumor cells. Therefore, these results describe for the first time a new Estradiol/CYP19A1/CTBP1/ miRNAs axis that explains, in part, the mechanism for prostate tumor growth increase by MeSFil: Massillo, Cintia Lorena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentin