Perfil genotípico e fenotípico da resistência à antimicrobianos de Staphylococcus aureus em cadeia produtiva de carne suína

Orientador: Dr. Luciano dos Santos BersotDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Defesa : Curitiba, 28/02/2019Inclui referências: p.72-93Área de Concentração: Saúde AnimalResumo: A carne suína é a mais consumida no mundo e uma importante fonte de proteína. Neste cenário o Brasil é o quarto produtor mundial e o Paraná está como terceiro produtor nacional. O sistema de confinamento é o principal meio de criação na região Sul, que é dividido em unidade produtora de leitões e de terminação, sendo responsável por suprir grande parte da demanda de carne. Este modelo é um importante meio de disseminação de patógenos. Entre os diversos patógenos, está Staphylococcus aureus, que é responsável por diversos problemas clínicos na suinocultura e em humanos. Este microorganismo possui natureza ubíqua sendo considerado um indicador de higiene na indústria de alimentos. O S. aureus pode causar doenças transmitida por alimentos (DTA), pela produção de enterotoxinas. Atualmente cepas resistentes à meticilina (MRSA) e vancomicina (VRSA), responsáveis por casos de infecções nosocomiais são as mais estudadas já que o MRSA está disseminado em ambientes extra hospitalares e tem sido isolado de vários animais domésticos, inclusive suínos. Deste modo, o objetivo do presente projeto foi rastrear a contaminação de S. aureus resistente a diferentes antimicrobianos na cadeia produtora de suínos. Foram identificados possíveis focos de contaminação durante o processo. O estudo foi conduzido em granjas de terminação de suínos e em abatedouro localizados no extremo oeste do Paraná. Com os resultados, obtivemos dados da contaminação nas etapas de produção, bem como identificação da disseminação de cepas de MRSA e o perfil de resistência para antimicrobianos da região estudada. Dez granjas de criação de suínos (terminação) e um frigorífico foram selecionados para coleta de 540 amostras ao longo da cadeia produtiva de carne suína, que foram submetidas a enumeração de SCP e S. aureus, e posterior isolamento e identificação molecular de S. aureus. A contaminação por Staphylococcus aureus foi dentro do limite aceitável (<2 log UFC/cm²) em 530 (98,1%) amostras, entre 2 e 3 logs UFC/cm² em 2 (0,4%) amostras, entre 3 e 4 logs UFC/cm², em 1 (0,2%) amostras e superior a 5 logs UFC/cm² 7 (1,3%) das amostras. Contagens superiores a 4 log UFC/cm² foram observadas em baias de terminação e pocilgas de espera. A enumeração de SCP foi possível em 20 (25%) isolados, sendo três (%) referente ao piso da baia na granja, 10 (1,8%) foi obtida da pocilga de espera no abatedouro e sete (1,3%) das amostras de carcaça após a sangria. Considerando as diferentes etapas de processamento, não foram observadas isolados SCP entre as demais amostras obtidas no ambiente de processamento e nos produtos finais. Um total de 20 isolados de SCP foram selecionados e caracterizados quanto ao perfil bioquímico, porem apenas 18 confirmaram a presença do gene femA para identificação de S. aureus. Assim, 18 isolados de S. aureus foram submetidos a caracterização de seus perfis de resistência em relação a 10 antimicrobianos, por testes de susceptibilidade e pela pesquisa de genes relacionados a resistência. Considerando os resultados fenotípicos, 100% dos isolados de S. aureus apresentaram resistência a sulfamethoxazole (SUL), a penicilina (PEN), a eritromicina (ERI) e a tetraciclina (TET); 94,40% a ciprofloxacina (CIP) e ao cloranfenicol (CLO); 88,8% a gentamicina e 16,6% a oxacilina (OXA), todos apresentaram sensibilidade a rifampicina (RIF) à vancomicina (VAN). Os 18 isolados foram resistentes a todos os antimicrobianos testados, sendo que três dos isolados (pocilga e carcaça) a oito antimicrobianos, 13 (baias, pocilgas e carcaças) apresentaram resistência a sete antibióticos, um referente a pocilga de espera foi resistente seis antimicrobianos e um isolado da carcaça foi a quatro antimicrobianos; o perfil de resistência a PEN-GEN-ERI-TET-CIP-SUL-C foi o que apresentou maior frequência entre os isolados de S. aureus (n = 13). Em relação aos genes relacionados a resistência a diferentes antimicrobianos, 100% dos isolados de S. aureus apresentaram resultados positivos para blaZ (PEN), 22,2% para femB (OXA); para gene mecA (OXA) 50% dos isolados; não foram observados resultados positivos para tetK (TET), vanA (VAN) e mecC (OXA). Entre os isolados de S. aureus, três não apresentaram nenhum dos genes pesquisados, quatro apresentaram apenas um dos genes isolados (blaZ, femB e mecA), cinco apresentaram simultaneamente os genes mecA-blaZ, cinco somente para o gene blaZ, e um os genes femB-blaZ. Os resultados obtidos demonstram a presença de SCP e S. aureus apenas nas etapas iniciais de produção, importante por se tratar de um indicador de manipulação e higiene dentro da cadeia produtiva de carne suína. Também verificamos a presença de cepas com multirresistência e heterorresistencia aos diferentes antimicrobianos testados, bem como a confirmação e cepas MRSA dentro dos isolados além da presença de heterorresistencia entre os isolados, mostrando a importância do monitoramento microbiológico por metodologias fenotípicas e moleculares. Palavras-chave: Multirresistência, carne suína, Staphylococcus coagulase positivaAbstract: Pork is the most consumed in the world and an important source of protein. In This scenario, Brazil is the fourth World producer and Paraná is the third national producer. The confinement system is the main means of creation in the southern region, which is divided into piglets and finishing units, being responsible for supplying much of the meat demand. This model is an important means of dissemination of pathogens. Among the various pathogens, Staphylococcus aureus is responsible for several clinical problems in swine farming and humans. This microorganism has a ubiquitous nature being considered an indicator of hygiene in the food industry. S. aureus can cause foodborne diseases (DTA) by the production of enterotoxins. Currently, Methicillinresistant (MRSA) and vancomycin (VRSA) strains, responsible for nosocomial infections are the most studied, since MRSA is disseminated in extra-hospital environments and has been isolated from several domestic animals, including Pigs. Thus, the objective of this project was to trace the contamination of S. aureus resistant to different antimicrobians in the pig-producing chain. Possible outbreaks of contamination Were identified during the process. The study was conducted in pig and slaughterhouse finishing farms located in the extreme west of Paraná. With the results, we obtained data from contamination in the stages of production, as well as identification of the dissemination of MRSA strains and the resistance profile for antimicrobians. Ten Pig Breeding Farms (finishing) and one refrigerator were selected to collect 540 samples along the pork production chain, which were subjected to the enumeration of SCP and S. aureus, and posterior isolation and molecular identification of S. Aureus. Contamination by Staphylococcus aureus was within the acceptable limit (< 2 log UFC/cm²) in 530 (98.1%) samples, between 2 and 3 logs UFC/cm² in 2 (0.4%) samples, between 3 and 4 UFC/cm² logs, in 1 (0.2%) samples and more than 5 logs UFC/cm² 7 (1.3%) of the samples. Counts greater than 4 log UFC/cm² were observed in finishing bays and waiting pig stable equipment. The SCP enumeration was possible in 20 (25%) isolated, three (%) regarding the floor of the bay in the farm, 10 (1.8, 1%) was obtained from the waiting pigsty in the slaughterhouse and seven (1.3%) of the carcass samples after sangria. Considering the different processing stages, no SCP isolates were observed between the other samples obtained in the processing environment and in the final products. A total of 20 SCP isolates were selected and characterized as to the biochemical profile, but only 18 confirmed the presence of the femA gene for identification of S. aureus. Thus, 18 isolates of S. aureus were subjected to characterization of their resistance profiles in relation to 10 antimicrobians, by susceptibility tests and by the research of genes related to resistance. Considering the phenotypic results, 100% of the S. aureus isolates showed resistance to sulfamethoxazole (SUL), penicillin (PEN), erythromycin (ERI) and tetracycline (TET); 94.40% ciprofloxacin (CIP) and chloramphenicol (CLO); 88.8% to gentamicin and 16.6% to oxacillin (OXA), all presented sensitivity to rifampicin (RIF) to vancomycin (VAN). The 18 isolates were resistant to all antimicrobials tested, and three of the isolates (pigsty and carcass) to eight antimicrobials, 13 (bays, pig stable equipment and carcasses) showed resistance to seven antibiotics, one referring to the waiting pigsty was resistant six antimicrobians and one isolate of the carcass was to four antimicrobians; The resistance profile to PEN-GEN-ERI-TET-CIP-SUL-C was the one that presented the highest frequency among S. aureus isolates (n = 13). In relation to the genes related to resistance to different antimicrobians, 100% of the isolates of S. aureus presented positive results for blaZ (PEN), 22.2% for femB (OXA); For mecA gene (OXA) 50% of the isolates; No positive results were observed for tetK (TET), vanA (VAN) and mecC (OXA). Among the isolates of S. aureus, three did not present any of the studied genes, four presented only one of the isolated genes (blaZ, femB and mecA), five simultaneously presented the mecA-blaZ genes, five only for the blaZ gene, and one the femB-blaZ genes. The results obtained demonstrate the presence of SCP and S. aureus only in the initial stages of production, important because it is an indicator of manipulation and hygiene within the production chain of pork. We also verified the presence of strains with multidrug resistance and heterorresistence to the different antimicrobians tested, as well as confirmation and MRSA strains within the isolates, besides the presence of Heterorresistencia among the isolates, showing the Importance of microbiological monitoring by phenotypic and molecular methodologies. Keywords: multiresistance, swine meat, Staphylococcus coagulase positiv