Untersuchungen zur gerichteten Evolution einer Epoxidhydrolase aus \(\textit {Aspergillus niger}\)

Durch Methoden der gerichteten Evolution konnten Epoxidhydrolase-Varianten aus \(\textit {Aspergillus niger}\) generiert werden, welche eine gesteigerte Enantioselektivität in der hydrolytischen kinetischen Racematspaltung von Glycidylphenylether (GPE) zeigten. Nach einer Mutageneserunde mittels fehlerhafter PCR wurde eine Variante identifiziert, die im Vergleich zum Wildtypenzym eine Verdoppelung des Selektivitätsfaktors von E = 4.6 auf 10.8 bezüglich des Modellsubstrats GPE bewirkte. Die Variante enthält drei Aminosäureaustausche, von denen sich zwei Positionen räumlich vom katalytischen Zentrum entfernt befinden. Das verwendete Expressionssystem pGEF Asp-EH stellte sich als genetisch instabil heraus und musste durch ein neu konstruiertes (pQEEH) ersetzt werden, welches sich für ein Screening auf Enantioselektivität als effizient erwies. Ein Screening-Assay wurde soweit optimiert, dass mittels ESI-MS-Screening der E-Wert der kinetischen Racematspaltung von GPE und Styroloxid bestimmt wurde