Dissecting the pathogenesis of Machado-Joseph Disease in a new human disease model derived from induced pluripotent stem cells

Tese de doutoramento em Ciências Farmacêuticas, na área de especialização em Biotecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de CoimbraA doença de Machado-Joseph, também conhecida por ataxia espinocerebelosa tipo 3, é a ataxia autossómica dominante mais comum a nível mundial. A DMJ é uma doença neurodegenerativa de início tardio causado por uma expansão de CAGs na região codificante do gene ATXN3 localizado no cromossoma 14q32.1, sendo a mutação traduzida numa cadeia de poliglutaminas anormalmente longa na proteína ataxina-3. Com o desenvolvimento das células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs), o estudo da patologia da MJD deixou de estar restrito a modelos de doença artificiais, tais como modelos animais ou linhas celulares, que apresentam limitações como modelos de doenças neurodegenerativas. Nesse sentido, nesta tese, o nosso objectivo foi o de desenvolver um novo modelo in vitro humano para estudar a DMJ. Esta tese está organizada em 4 capítulos. No capítulo 1, é feita uma revisão acerca das principais características patológicas da MJD e também uma revisão acerca de modelos in vitro derivados de células estaminais pluripotentes induzidas. No capítulo 2 é descrito o desenvolvimento e investigação do fenótipo DMJ em fibroblastos adultos da derme de doentes. As culturas foram caracterizadas geneticamente e o fenótipo DMJ foi estudado neste tipo particular de células não-neuronais, atendendo à disfunção autofágica. Foi encontrada uma disfunção da autofagia relacionada com o fenótipo DMJ, em particular, níveis reduzidos de beclina-1 e redução de formação de autofagossomas. No capítulo 3, reportamos o sucesso da geração de iPSCs a partir das culturas de fibroblastos da derme previamente estabelecidas. Foi utilizado um vector lentiviral para expressar os 4 factores de reprogramação (Sox2, Oct4, Klf4 e c-Myc) na reprogramação dos fibroblastos humanos adultos da derme. A pluripotência destas células foi totalmente caracterizada, atendendo aos critérios de morfologia, marcadores moleculares, como a actividade da fosfatase alcalina, expressão de marcadores de superfície e de factores de transcrição nucleares e de genes associados à pluripotência celular; e de ensaios funcionais, particularmente os ensaios de diferenciação in vitro e in vivo. Verificámos ainda que estas células mantiveram o cariótipo diploide e o genótipo da doença, apresentando-se em perfeitas condições para serem diferenciadas em culturas neuronais de DMJ. No capítulo 4 é descrita a diferenciação das iPSCs em neurónios específicos de doentes e um estudo da patogénese da DMJ. Verificámos que a autofagia está comprometida em culturas precoces de neurónios DMJ, fornecendo evidência de que a desregulação dos mecanismos de clearance de proteínas é um evento precoce na DMJ. Verificámos ainda que a localização subcelular da ataxina-3 é alterada na presença de níveis aumentados de Ca2+ em neurónios MJD, deslocando-se do citoplasma para o núcleo, onde foi detectada na forma de pequenos agregados. Em conclusão, esta tese evidencia que as iPSCs obtidas de doentes DMJ são uma ferramenta poderosa no contexto de modelação da doença, criando a oportunidade única de gerar neurónios específicos de doentes DMJ e o estudo da doença. Além disso, os nossos resultados demonstram ainda que os neurónios humanos obtidos por diferenciação são uma plataforma para estudos futuros de novas terapêuticas e desenvolvimento de fármacos.Machado-Joseph disease, also called spinocerebellar ataxia type 3 (MJD/SCA3), is the most frequent autosomal dominantly-inherited ataxia worldwide. MJD is a late onset neurogenerative disease caused by a CAG expansion within the coding region of the ATXN3 gene mapped to chromosome 14q32.1, resulting in an abnormal polyglutamine tract within the ataxin-3 protein. With the development of induced pluripotent stem cells (iPS) cells, the study of the pathology of MJD is no longer restricted to artificial disease models, such as animal models or cell lines, which present limitations as models for neurogenerative disorder. Therefore, in this thesis we aimed at developing a new human in vitro model to study MJD. The thesis is organized in 4 chapters. In chapter 1, a review of the MJD main pathogenesis characteristics is presented, along with a review of iPSCs-derived in vitro models. In chapter 2, we describe the generation and investigation of the MJD phenotype in patient adult dermal fibroblasts. We characterized genetically those cultures and studied the MJD phenotype on this particular type of non-neuronal cells, regarding autophagy dysfunction. We found autophagy impairments related with MJD phenotype in these cells, particularly a decrease in beclin-1 levels and reduction of autophagosome formation. In chapter 3, we report the successful generation of iPS cells from the previous established cultures of dermal fibroblasts. We used a lentiviral vector encoding for the 4 reprogramming factors (Sox2, Oct4, Klf4 and c-Myc) for reprogramming the human adult dermal fibroblasts into iPS cells. We fully characterized the pluripotency of those cells regarding the criteria of morphology, molecular markers, such as the alkaline phosphatase activity and expression of cell surface markers, nuclear transcription factors and pluripotency related genes; and functional assays, particularly the in vitro and in vivo differentiation potential. We found that these cells retained a diploid karyotype and the disease genotype, being in the perfect conditions to be differentiated in MJD neuronal cultures. In chapter 4, we describe the differentiation of iPS cells in patient-specific neurons and the study of the pathogenesis of MJD. We found that autophagy is impaired in early cultures of MJD neurons, providing evidence that the initial pathogenesis of MJD concerning the deregulation of protein clearance mechanisms is an early event. Also ataxin-3 subcellular localization changed in the presence of increased intracellular levels of Ca2+ in MJD neurons, from the cytoplasm to the nucleus, where it was detected in the form of small aggregates. In conclusion, this thesis provides evidence that MJD patient derived iPS cells are a powerful tool in the context of disease modeling. They provide a unique opportunity to generate MJD patient-specific neurons, allowing the study of the disease. Furthermore, our results show that MJD can be robustly modeled and the derived human MJD neurons are a platform for the investigation of new therapeutics and drug development