Síntese, caraterização fotofísica e avaliação biológica de promissores agentes de teranóstico para o cancro

Dissertação de Mestrado em Química Medicinal apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaEste projeto centrou-se no desenvolvimento de novos fotossensibilizadores (PS) para serem aplicados em terapia fotodinâmica (PDT) do cancro e, simultaneamente, serem usados no diagnóstico através da obtenção de imagem biológica (agentes de teranóstico). O grupo de investigação em Química Orgânica havia anteriormente relatado a síntese de um novo tipo de clorinas de platina(II), obtidas através de uma reação de cicloadição [8π+2π] do anião metil diazafulvénio com porfirinas de platina(II). Estas clorinas revelaram interessantes propriedades luminescentes na região espetral do vermelho e infravermelho próximo (NIR) e intensas bandas de absorção dentro da janela espectral terapêutica (~590 nm). Estas características fotofísicas e fotoquímicas favoráveis, combinadas com a elevada estabilidade térmica, tornam estes compostos excelentes matéria-prima para serem estudados como agentes de teranóstico. Neste contexto, na Parte I desta dissertação é descrita a síntese de um conjunto de clorinas de platina com diferentes grupos substituintes no seu macrociclo tetrapirrólico (Ar = Ph, 4-ClC6H4 e 4-MeOC6H4) e com diferentes polaridades (ésteres, ácidos e álcoois). Estes PS foram caracterizados por RMN 1H, RMN 13C, espectrometria de massa e espectroscopia de absorção UV-visível. Atendendo a que se tem comprovado que a agregação dos PS usados em PDT tem um papel decisivo na sua atividade fotodinâmica, pela dificuldade de incorporação pelas células e pela diminuição da geração de oxigénio singleto (considerada por vários autores como a principal espécie citotóxica produzida na terapia fotodinâmica), estes complexos de platina também foram estudados quanto à sua agregação num meio aquoso (PBS). Tendo-se verificado que agregavam procedeu-se a um estudo de desagregação usando diferentes surfactantes neutros. Os surfactantes estudados foram o Glicerol, Pluronic F127, Pluronic P123 e Tween 20. Na Parte II deste trabalho experimental, procedeu-se à verificação da citotoxicidade no escuro dos dois surfactantes que demonstraram espetroscopicamente desagregar as metaloclorinas de platina. Estes surfactantes foram o Pluronic P123 e o Tween 20. A linha celular tumoral usada foi de melanoma melanocítico (A375). Com este estudo comprovou-se que a citotoxidade destes desagregantes era significativamente superior à do veículo previamente usado (dimetilsulfóxido), razão pela qual os ensaios biológico prosseguiram com os compostos na forma agregada. Posteriormente, ainda na Parte II, pretendeu-se verificar o efeito fotodinâmico destas clorinas em três linhas celulares tumorais humanas, esclarecendo deste modo as suas vias moleculares de atuação. As linhas celulares tumorais usadas foram de carcinoma da bexiga (HT1376), carcinoma do esófago (OE19) e melanoma melanocítico (A375). O ensaio de MTT permitiu verificar que o valor de concentração para a inibição de 50 % da atividade metabólica (IC50) de alguns destes PS nas três linhas celulares tumorais foi na ordem de nanomolar, o que aponta para um efeito terapêutico promissor. Entre os complexos de platina estudados, verificou-se que as metaloclorinas com caraterísticas mais hidrofílicas (ácidos e álcoois) tinham um maior efeito na inibição da atividade metabólica, e que os complexos com Ar = Ph eram mais potentes, do que os correspondentes complexos com Ar = 4-ClC6H4 e Ar = 4-MeOC6H4. A linha tumoral do melamoma melanocítico foi a que demonstrou ser a mais sensível ao efeito destes derivados. Sabendo que determinados fotossensibilizadores exibem uma elevada seletividade para as células tumorais, estudou-se também o efeito dos fotossensiblizadores 11a e 12a numa linha não tumoral, a linha humana de fibroblastos HFF1, não se verificando diferenças estatisticamente significativas. Foi demonstrado que o decréscimo da atividade metabólica, nas células submetidas à PDT estava relacionado com os mecanismos de morte celular, a disfunção mitocondrial e a produção intracelular de espécies reativas de oxigénio (ROS). O tipo de morte celular ativado, apoptose ou necrose, é influenciado pela concentração dos fotossensibilizadores. Várias ROS estão implicadas no efeito fotodinâmico dos fotossensibilizadores 11a e 12a e os mecanismos citoprotetores não parecem ser suficientes para inibir os danos celulares. Com este trabalho, foi possível concretizar o objetivo de desenvolver um agente de teranóstico e, caracterizar as suas vias subcelulares de atuação, ainda que estes fotossensibilizadores se encontrem na sua forma agregada. Todos os resultados biológicos obtidos neste estudo poderão estar sujeitos a melhoria utilizando surfactantes não citotóxico per si.This project focused on the development of new photosensitizers (PS) to be applied in cancer photodynamic therapy (PDT) and, simultaneously, to be used in the diagnosis by obtaining a biological image (theranostic agents).The Organic Chemistry research group had previously reported the synthesis of a new type of platinum(II) chlorins obtained through an [8π+2π] cycloaddition reaction of the diazafulvenium methides with platinum(II) porphyrins. These chlorins revealed interesting luminescent properties in the red and near infrared (NIR) regions and intense absorption bands within the spectral therapeutic window (~590 nm). These favourable photophysical and photochemical characteristics, combined with the high thermal stability, make these compounds excellent materials to be studied as theranostic agents.In this context, in Part I of this dissertation, it is described the synthesis of a set of platinum chlorins with different substituent groups in their tetrapyrrolic macrocycle (Ar = Ph, 4-ClC6H4 and 4-MeOC6H4) and with different polarities (esters, acids and alcohols). These PS were characterized by 1H NMR, 13C NMR, mass spectrometry and UV-visible absorption spectroscopy. Considering that it has been proven that the aggregation of PS used in PDT plays a decisive role in its photodynamic activity, due to the difficulty of incorporation by the cells and the decrease in the generation of singlet oxygen, these platinum complexes were also studied for their aggregation in an aqueous medium (PBS). Having been found that they aggregate, a disaggregation study using different neutral surfactants was carried out. The surfactants studied were Glycerol, Pluronic F127, Pluronic P123 and Tween 20.In Part II of this experimental work, the dark cytotoxicity of the two surfactants which demonstrated spectroscopically the disaggregation of the metallochlorins, was performed. These surfactants were Pluronic P123 and Tween 20. The tumour cell line used was melanocytic melanoma (A375). With this study it was found that the cytotoxicity of these surfactants was significantly higher than the vehicle previously used (dimethylsulfoxide), whereby the biological assays proceeded with the compounds in the aggregate form.Subsequently, it was intended to verify the photodynamic effect of these chlorins in three human tumour cell lines, clarifying their molecular pathways of action. The tumour cell lines used were bladder carcinoma (HT1376), esophageal carcinoma (OE19), and melanocytic melanoma (A375). The MTT assay showed that the concentration value for the 50% inhibition of the metabolic activity (IC50) of some of these PS in the three tumour cell lines was in the nanomolar range, which points to a promising therapeutic effect. Among the platinum complexes studied, it was found that metallochlorins with more hydrophilic characteristics (acids and alcohols) had a greater effect on the inhibition of metabolic activity, and that the complexes with Ar = Ph were more potent than the complexes with Ar = 4-ClC6H4 and Ar = 4-MeOC6H4. The melanocytic melanoma tumour line was shown to be the most sensitive to the effect of these derivatives.Knowing that certain photosensitizers exhibit high selectivity for tumour cells, the effect of photosensitizers 11a and 12a in a non-tumour line, the human HFF1 fibroblast line, was also studied, and no statistically significant differences were observed. The decrease in metabolic activity in cells submitted to PDT was shown to be related to the mechanisms of cell death, mitochondrial dysfunction and intracellular production of reactive oxygen species (ROS). The type of activated cell death, apoptosis or necrosis, is influenced by the concentration of the photosensitizers. Several ROS are involved in the photodynamic effect of photosensitizers 11a and 12a and cytoprotective mechanisms do not appear to be sufficient to inhibit cell damage. With this work, it was possible to achieve the goal of developing a theranostic agent and to characterize its subcellular pathways, even though these photosensitizers are in their aggregate form. All biological results obtained in this study may be subject to improvement using non-cytotoxic surfactants