In vitro effects of betamethasone and dexamethasone in microglia: structure-activity correlation study

Dissertação de Mestrado em Química Medicinal apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaThe exposure to synthetic glucocorticoids was described as a risk factor for the genesis of cardiovascular diseases, psychiatric disorders, metabolic disorders and neuroimmune disorders, mediated by the hypothalamic–pituitary–adrenal axis. Pregnant women at risk of preterm delivery are treated with synthetic glucocorticoids to promote the fetal lung maturation, decreasing neonatal mortality. The synthetic glucocorticoids commonly used are dexamethasone and betamethasone, which are epimer diastereomers. Our group previously described that the prenatal exposure to dexamethasone is anxiogenic in Wistar rats, also promoting a morphological remodeling of microglia. Microglia, immune cells of the central nervous system, possess an essential developmental role concerning their abilities to produce and release cytokines and to prune the developing synapses. The immune system has been associated with psychiatric disorders, as depression, reinforcing the involvement of microglia in the hypothalamic–pituitary–adrenal axis induced abnormalities after exposure to synthetic glucocorticoids. The main objective of this study is to evaluate the physiological roles of microglia in the presence of both drugs, dexamethasone and betamethasone. We also aim to identify the alterations promoted by the effect of these drugs in the glucocorticoid receptor, since both drugs are agonists of this receptor.To evaluate microglial responses to the short- and long-term exposure to dexamethasone and betamethasone, a microglial cell line, BV-2, was incubated with these drugs for 6 and 24 hours, respectively. In general, both glial reactivity markers and inflammatory markers increased after the incubation, without changing the phagocytic ability. On the other hand, the fractalkine receptor density was affected only after 6 hours of exposure to dexamethasone. Thus, we concluded that microglia are in an activated polarized M1 phenotype, proinflammatory, after exposure to both drugs. However, microglia-neurons communication, through the fractalkine receptor, was only affected by dexamethasone, but the effects of this drug are not only mediated by the glucocorticoid receptor. In fact, only the increased expression of Ionized calcium binding adaptor molecule 1 (IBA-1), major histocompatibility complex, class II (MHC-II) and adenosine A2A receptor (A2AR) was triggered by dexamethasone and the increase in the tumor necrosis factor (TNF) expression triggered by both drugs was mediated by this receptor. This raises the hypothesis of the involvement of the other corticosteroid receptor, the mineralocorticoid receptor. More studies are necessary to better understand the consequences of the prenatal exposure to dexamethasone and betamethasone on microglia and its association with the increased susceptibility to develop neuropsychiatric disorders. Structure-activity studies are necessary to disclose the differences of these drugs regarding their stereochemistry alterations. Since some changes in microglia are not mediated by the glucocorticoid receptor, this is of major importance to identify the action mechanisms of these drugs.Estudos epidemiológicos e estudos em animais reportam o aumento do risco de doenças cardiovasculares, de doenças psiquiátricas, de distúrbios metabólicos e de disfunções neuroendócrinas durante a vida, após exposição a glucocorticóides sintéticos e mediação pelo eixo hipotálamo-hipófise-suprarrenal. Em casos de risco de parto prematuro são administrados às gestantes glucocorticóides sintéticos durante a gravidez, com o intuito de promover a maturação fetal pulmonar e reduzir o risco de morte neonatal. Os glucocorticóides sintéticos usados são a dexametasona e a betametasona, diastereoisómeros epímeros. De facto, trabalhos anteriores do nosso grupo demonstram que a administração pré-natal de dexametasona desencadeia um fenótipo do tipo ansioso nos ratos, correlacionado com alterações nas células da microglia. As células da microglia, células imunes do sistema nervoso central, têm um papel crucial nestas fases precoces do neurodesenvolvimento, sendo responsáveis pela construção de uma rede neuronal saudável devido às suas capacidades de libertação de citocinas e de fagocitose de elementos celulares. De facto, o sistema imune tem sido correlacionado com alterações psiquiátricas, incluindo o desenvolvimento da depressão, o que evidencia ainda mais o papel destas células nas alterações mediadas pelo eixo hipotálamo-hipófise-suprarrenal após exposição a glucocorticóides sintéticos. O principal objetivo deste trabalho consiste em avaliar as funções fisiológicas das células da microglia tendo em conta a diferença estereoquímica entre os dois fármacos, dexametasona e betametasona. Pretende-se também identificar se as alterações produzidas pelos fármacos são mediadas pelo recetor glucocorticóide, sendo que estes fármacos são agonistas deste recetor. Durante todo o trabalho foi usada uma linhagem de células da microglia, as BV-2. Estas foram incubadas com dexametasona e betametasona durante 6 e 24 horas, com o intuito de avaliar as células da microglia após uma curta e uma longa exposição aos glucocorticóides, respetivamente. De um modo geral, quer os marcadores de reatividade glial, quer os marcadores inflamatórios aumentam após incubação com os fármacos. No entanto, a capacidade fagocítica mantêm-se inalterada. Por sua vez, a densidade do recetor da fratalquina apenas é afetada após uma exposição de 6 horas à dexametasona. De facto, podemos concluir que as células da microglia estão num estado de ativação e são polarizadas num fenótipo M1, pró-inflamatório, após exposição a ambos os fármacos. No entanto, a comunicação microglia-neurónios, através do recetor da fratalquina, apenas é afetada pela dexametasona. No entanto, nem todos os efeitos provocados por estes fármacos são mediados pelo recetor glucocorticóide. De facto, apenas o aumento na expressão da molécula adaptadora de ligação ao cálcio ionizado 1 (IBA-1), do complexo principal de histocompatibilidade, classe II (MHC-II) e do recetor A2A da adenosina (A2AR) provocado pela betametasona e também o aumento na expressão do fator de necrose tumoral (TNF) provocado por ambos os glucocorticóides sintéticos é mediado por este recetor. Estes resultados levantam a hipótese de as alterações observadas serem mediadas pelo outro recetor corticosteróide, o recetor mineralocorticóide. Mais estudos de investigação são necessários a fim de perceber as consequências dos efeitos provocados pela dexametasona e pela betametasona na microglia após exposição pré-natal, bem como a sua relação com o aumento da suscetibilidade a doenças psiquiátricas. É relevante também fazer mais estudos de estrutura-atividade entre estes dois diastereoisómeros epímeros a fim de perceber a importância da alteração estereoquímica entre os dois. Uma vez que a maioria das alterações nas células da microglia não são mediadas pelo recetor glucocorticoide, é pertinente identificar os mecanismos pelos quais acontecem estas alterações.FC