New materials for the improved oxygenation of cell cultures and tissue engineering scaffolds

Trabalho de Projeto do Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica apresentado à Faculdade de Ciências e TecnologiaA oxigenação define-se como o processo através do qual os organismos aeróbios têm acesso ao oxigénio molecular, O2, em sistemas biológicos. Este elemento é importante no microambiente celular in vivo, em sistemas de culturas celulares in vitro, e em sistemas para aplicações em Engenharia de Tecidos. Uma das problemáticas transversais aos atuais sistemas utilizados para mimetizar as condições das células em ambiente fisiológico, e nos scaffolds desenvolvidos para aplicações em Engenharia de Tecidos, é a oxigenação insuficiente do meio, que pode originar situações de hipoxia que culminam na morte celular. No entanto, apesar de já existirem materiais transportadores e/ou geradores artificiais de O2, estes ainda apresentam limitações no que diz respeito à estabilidade, toxicidade e modulação da libertação de O2 no tempo, para que desempenhem a função pretendida de forma eficiente.Neste trabalho propõe-se a preparação de um sistema inovador baseado em nanocápsulas de sílica, contendo no seu interior um líquido iónico (LI) que possui capacidade para absorver, reter e/ou libertar quantidades apreciáveis de O2, mantendo a sua estabilidade química e mecânica. O LI escolhido é da família dos fosfónios, [P6,6,6,14][NTf2].As nanocápsulas de sílica do tipo core/shell (nc/Si-LI) foram desenvolvidas por combinação de técnicas de microemulsão e método sol-gel em meio aquoso. Paralelamente, foram desenvolvidos scaffolds do tipo polimérico, à base de colagénio e ácido hialurónico, como estrutura para incorporação das nc/Si-LI sintetizadas e de suporte ao crescimento, proliferação e diferenciação celular. Para a preparação dos scaffolds, os polímeros escolhidos são caracterizados por estimularem a migração e divisão celular, e por possuírem excelente biocompatibilidade, imunoneutralidade e biodegradabilidade controlável. Por forma a estabilizar a estrutura destes polímeros, o scaffold foi reticulado com EDC e sulfo-NHS.Todos os materiais preparados foram caracterizados por diferentes técnicas. Os diâmetros hidrodinâmicos das emulsões de LI e das nc/Si-LI formadas foram avaliados através de DLS, sendo que o diâmetro das nc/Si-LI foi também determinado por SEM e STEM. A carga à superfície das nc/Si-LI foi aferida por medidas de potencial zeta, a composição química das nc/Si-LI foi identificada por FTIR e os rendimentos das reações foram estimados a partir dos dados do TGA. Os ensaios de citotoxicidade, LDH e WST-1, para as células Balb/3T3, foram realizados para todos os materiais desenvolvidos, tendo sido testadas diferentes concentrações e formulações de nc/Si-LI, LI puro, scaffolds com e sem nc/Si-LI incorporadas, e nanopartículas de sílica mesoporosa, como controlo. Finalmente, os materiais desenvolvidos foram sujeitos a testes para avaliar a sua capacidade de absorver/libertar oxigénio. De forma resumida, os principais resultados obtidos ao longo deste trabalho permitiram concluir que as emulsões de LI para o tempo de sonicação de 25 minutos permanecem estáveis até 72 horas após a sua formação e um diâmetro hidrodinâmico de 262,2 nm. As nc/Si-LI obtidas apresentam dimensões numa gama adequada à sua utilização para oxigenação de meios de cultura de células e scaffolds para Engenharia de Tecidos (50-300 nm) e que a sua superfície é carregada negativamente (<-28 mV). A análise de TGA permitiu calcular eficazmente a quantidade de LI e de sílica presente em cada amostra. Os ensaios de absorção e libertação de O2 permitiram concluir que as nc/Si-LI, as emulsões de LI e os scaffolds, sem e com incorporação de nc/Si-LI, são capazes de consumir e de libertar O2, o que é de elevada importância para a sua utilização como scaffold para oxigenação.Apesar de os resultados respeitantes aos ensaios de citotoxicidade não terem sido muito positivos, uma vez que foi provado que o LI utilizado neste trabalho é citotóxico, é possível contornar-se esta situação procedendo a alterações no sistema, como, por exemplo, escolher outro LI hidrofóbico menos citotóxico (p.e., da família das colinas ou imidazólios, ou então proceder-se à troca do anião por outro menos hidrofóbico, sem que a hidrofobicidade do LI seja comprometida) ou proceder-se à otimização do revestimento de sílica, por forma a que não ocorra lixiviação do LI no meio em que é administrado (p.e., espessura, porosidade). Com este trabalho fica demonstrado que é possível encapsular um LI hidrofóbico em nanocápsulas de sílica, usando técnicas de microemulsão com sistemas de surfactantes adequados, combinadas com métodos de sol-gel em meio aquoso. Foi também demonstrado que as nanocápsulas e os scaffolds com nc/Si-LI incorporadas apresentavam caraterísticas favoráveis para a sua aplicação em sistemas de oxigenação para meio de cultura celular ou para suporte polimérico em Engenharia de Tecidos. No futuro próximo próximo espera-se que a otimização das nanocápsulas torne o sistema desenvolvido útil para o proposto definido.Oxygenation is defined as the process by which all the living organisms receive molecular oxygen, O2, in biological systems. O2 is a key element in the in vivo microenvironment and in in vitro and ex vivo systems with applications in Tissue Engineering. One of the main problems of the present systems that mimic the cell is conditions and environment in the physiological context, as well as in the scaffolds developed for Tissue Engineering applications, lies in the lack of oxygenation in the medium, leading to hypoxia and culminating with cell dead. To overcome this problem, molecules/materials that can act as artificial carriers and/or generators of O2 were developed. However, the proposed alternatives still present limitations in what regards to its stability, toxicity, and modulation of the O2 release over time, for them to play their role/function in a proper and efficient way.In this work it is proposed an innovative system that comprises silica nanocapsules, with an ionic liquid (IL) in its core that has a high capacity to absorb, retain and release considerable amounts of O2, without having it affecting its mechanical and chemical stability. The selected IL belongs to the phosphonium family, [P6,6,6,14][NTf2].The core/shell nanocapsules were obtained through the combination of microemulsion and sol-gel techniques in aqueous medium. At the same time, polymeric scaffolds from hyaluronic acid and collagen were developed, as structures for the incorporation of the synthetized nanocapsules and as cell growth, proliferation and differentiation support.For the preparation of the scaffolds the chosen polymers are known for stimulating cell migration and proliferation, whilst presenting high levels of biocompatibility, immunoneutrality and controllable biodegradability. To stabilize the structure of these polymers, EDC and sulfo-NHS were used as crosslinking agents.All the prepared materials were subjected to different characterization techniques. The hydrodynamic diameters of the IL emulsion and nc/Si-IL were evaluated by DLS, also the nc/Si-IL diameter was obtained from SEM and STEM. The charge on the surface of the nc/Si-IL was measured by Zeta Potential, the nc/Si-IL chemical composition was given by FTIR, and the reactions yield calculated from the data of the TGA. The cytotoxicity assays LDH and WST-1 were performed for all the materials using Balb/3T3 cells. Different concentrations of nc/Si-LI, pure IL, scaffolds with and without nc/Si-IL, and mesoporous silica nanoparticles, as control, were tested. Finally, the developed materials were submitted to O2 sorption/release tests, in order to evaluate their capability to absorb/release O2.Briefly, the data collected over this work allowed to conclude that the IL emulsion obtained for 25 minutes of sonication remains stable for at least 72 hours after formation and that the micelles present a hydrodynamic diameter of 262,2 nm. The nc/Si-IL dimensions varies in a range that is appropriate to their application for cell culture mediums and tissue engineering scaffolds oxygenation (50-300 nm), also their surface is negatively charges (<-28 mv), for both samples. The information given by TGA enabled the IL and silica percentages calculation in each analysed sample. Also concluded that the type of processing to which the nc/Si-LI were submitted did not affect the reaction rates. The O2 sorption and release assays provided valuable information about the capacity of all the samples to capture and release O2, IL emulsion, nc/Si-LI and scaffolds with and without nc/Si-IL. This as to be the main feature of the material, since the goal is to raise the levels of O2 at the implantation site, hence improving the cell viability and proliferation. Although the cytotoxicity assays results were not extremely positive, it was proved that the IL used in the present work is cytotoxic, it is possible turn the situation around by making alterations in the developed systems. For example, to choose another hydrophobic IL less cytotoxic (i.e., cations from the choline and imidazolium families, or to change the anion for another one less hydrophobic, without compromising the overall hydrophobicity). Another possible option is to optimize the features of silica shell (i.e., thickness, porosity), this way the lixiviation of IL to the medium can be avoided. In this work the hydrophobic IL was successfully encapsulated in silica nanocapsules, by applying microemulsion and sol-gel techniques to surfactants systems suitable for the purpose. Moreover, it was demonstrated that the nc/Si-LI and the scaffolds with nc/Si-LI have favourable features for future application in systems for cell culture oxygenation, as well as, for polymeric support for Tissue Engineering. In the future, its intended to improve this nanocapsules system in order to make it viable and useful for the desired purpose