Phytochemical characterization and biological activities of Crithmum maritimum L.

Dissertação de Mestrado em Segurança Alimentar apresentada à Faculdade de FarmáciaCrithmum maritimum é uma planta da família Apiaceae, típica da zona do Mediterrâneo, usada como alimento fresco, na medicina tradicional e com aplicações mais recentes na indústria cosmética. As suas potenciais utilizações não estão totalmente descritas cientificamente, pelo que se justifica ampliar o seu estudo. Contudo, há já algumas atividades biológicas associadas ao seu óleo essencial. Neste contexto, o objetivo deste trabalho consistiu em valorizar o óleo essencial (OE) bem como a água residual da hidrodestilação (AHD), rica em compostos fenólicos, não só pela sua caraterização química como também pela avaliação das suas atividades antioxidante, anti-inflamatória e anti-fúngica. O OE foi obtido por hidrodestilação e a AHD resultante deste processo extrativo foi sujeita a evaporação a vácuo e liofilização, tendo sido posteriormente caraterizada com recurso a cromatografia em camada fina (TLC) e cromatografia de alta resolução com deteção de fotodíodos (HPLC-DAD). A AHD evidenciou um perfil rico em ácidos fenólicos do tipo hidroxicinâmico e pequenas quantidades de flavonóides. A caraterização do OE foi obtida por GC e GC-MS e permitiu identificar como constituintes maioritários γ-terpineno, sabineno e timol metil éter.Foram avaliadas as propriedades antifúngicas do OE e da AHD no que diz respeito a leveduras e fungos filamentosos (Candida spp., Cryptococcus neoformans, dermatófitos e Aspergillus spp.), conhecidos como agentes patogénicos de patologias fúngicas prevalentes. A avaliação da concentração mínima inibitória (MIC) e da concentração letal mínima (MLC) permitiu concluir que o OE de C. maritimum tem uma atividade significativa, especialmente em Cryptococcus neoformans (com MIC de 0.26 mg/mL e MLC de 0.52 mg/mL), Epidermophyton floccosum e Microsporum canis (MIC e MLC com valor de 0.52 mg/mL). Adicionalmente o óleo demonstrou inibir o tubo germinativo e a formação de biofilmes de C. albicans, sugerindo um potencial interesse do óleo essencial de C. maritimum para o tratamento de candidíase, associado à presença dos seus compostos maioritários. A AHD demonstrou não exercer atividade antifúngica para as estirpes testadas (MIC e MLC >5 mg/mL).Tendo em conta que dados de estudos prévios sublinhavam a atividade antioxidante diminuta do OE e um potencial antioxidante de relevância para extratos de compostos não voláteis, associados à presença de ácido clorogénico, fez-se um estudo de atividade antioxidante baseado na capacidade de neutralização do radical DPPH apenas para a AHD, tendo o extrato apresentado um valor de IC50 de 0.68 ± 0.16 mg/mL. O estudo realizado demonstrou também que esta atividade é essencialmente devida à presença de ácidos fenólicos, principalmente ao ácido clorogénico mas também ao flavonol presente no extrato.A atividade anti-inflamatória, relativamente à qual não havia qualquer estudo nem em OE nem em extratos fenólicos de C. maritimum, foi avaliada. Os resultados permitiram concluir que o OE apresentou um IC50 de 0.01225 ± 0.00192 mg/mL. O óleo essencial reduziu significativamente a produção de óxido nítrico em macrófagos estimulados com LPS a uma concentração de 0.003 mg/mL sem comprometer a viabilidade celular. Esta atividade do OE poderá ser atribuída à atividade dos compostos maioritários, já que estes demonstraram também ter atividade. Relativamente à AHD, esta não demonstrou ter atividade anti-inflamatória. Em conclusão, este trabalho permitiu avaliar pela primeira vez o potencial anti-inflamatório do óleo essencial de C. maritimum, bem como a sua atividade antifúngica no que diz respeito aos fatores de virulência de C. albicans. Permitiu ainda evidenciar, pela primeira vez, a composição fenólica da AHD, bem como o seu potencial biológico no que diz respeito à sua atividade antioxidante. Estes resultados salientam a importância do reaproveitamento da água resultante do processo de extração do óleo essencial de C. maritimum, como fonte de compostos bioativos, atribuindo assim um valor adicional a esta planta aromática. Todo o estudo evidencia a possibilidade de uma maior utilização de Crithmum maritimum, com aplicações alimentares e medicinais.Crithmum maritimum is a plant of the Apiaceae family, typical of the Mediterranean zone, used as fresh food, in traditional medicine and with more recent applications in the cosmetic industry. Its potential uses are not fully described scientifically, and it is therefore justified to extend its study. However, there are already some biological activities associated with its essential oil. In this context, the objective of this work was to evaluate the essential oil (EO) as well as the hydrodistillation residual water (HRW), rich in phenolic compounds, not only for its chemical characterization but also for the evaluation of its antioxidant, anti-inflammatory and antifungal activities. The EO was obtained by hydrodistillation and the HRW resulting from this extraction process was subjected to vacuum evaporation and freeze-drying and was later characterized by thin layer chromatography (TLC) and high resolution chromatography with photodiode detection (HPLC-DAD). HRW showed a profile rich in hydroxycinnamic phenolic acids and small amounts of flavonoids. The EO characterization was obtained by GC and GC-MS and allowed the identification of γ-terpinene, sabinene and thymol methyl ether as major constituents. The antifungal properties of the EO and HRW were evaluated for yeast and filamentous fungi (Candida spp., Cryptococcus neoformans, dermatophytes and Aspergillus spp.), known as pathogens of prevalent fungal pathologies. The evaluation of minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum lethal concentration (MLC) allowed us to conclude that C. maritimum EO has a significant activity, especially in Cryptococcus neoformans (with MIC of 0.26 mg / mL and MLC of 0.52 mg/mL), Epidermophyton floccosum and Microsporum canis (MIC and MLC with a value of 0.52 mg/mL). In addition, the oil has proved to inhibit the germ tube and biofilm formation of C. albicans, suggesting a potential interest of C. maritimum essential oil for the treatment of candidiasis, associated with the presence of its major compounds. AHD demonstrated no antifungal activity for the strains tested (MIC and MLC> 5 mg/mL). Considering that data from previous studies highlighted the low antioxidant activity of EO and a relevant antioxidant potential for extracts of non-volatile compounds associated with the presence of chlorogenic acid, a study of antioxidant activity was conducted based on the neutralizing capacity of the radical DPPH only for HRW. As a result, the extract presented an IC50 value of 0.68 ± 0.16 mg/mL. The study also demonstrated that this activity is essentially due to the presence of phenolic acids, mainly chlorogenic acid but also to the flavonol present in the extract. The anti-inflammatory activity, for which there was no study in either the EO or phenolic extracts of C. maritimum, was evaluated. The results allowed to conclude that EO presented an IC50 of 0.01225 ± 0.00192 mg/mL. The essential oil significantly reduced the production of nitric oxide in LPS-stimulated macrophages at a concentration of 0.003 mg/mL without compromising cell viability. This activity of EO can be attributed to the activity of the major compounds, since these have also shown to have activity. Regarding HRW, it has not shown any anti-inflammatory activity. In conclusion, this work allowed to evaluate for the first time the anti-inflammatory potential of the essential oil of C. maritimum, as well as its antifungal activity with respect to the virulence factors of C. albicans. It also allowed to demonstrate, for the first time, the phenolic composition of HRW, as well as its biological potential with respect to its antioxidant activity. These results highlight the importance of the reuse of water resulting from the extraction process of the essential oil of C. maritimum as a source of bioactive compounds, thus giving an additional value to this aromatic plant. The whole study evidences the possibility of a greater use of Crithmum maritimum, with food and healthcare applications