Micelas Poliméricas para melhorar a entrega de Salinomicina a células de cancro.

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia Farmacêutica apresentada à Faculdade de FarmáciaIntrodução: A abordagem de utilizar nano medicina para tratar dentre outras doenças, o cancro vem sendo utilizada e estudada cada vez mais para ultrapassar as barreiras encontradas na terapia convencional. A utilização do polímero anfifílico não tóxico como o Pluronic F127 para a formação de nano partículas traz grandes vantagens por formar micelas de substâncias biologicamente ativas com tamanhos de 10 a 100 nm que tem como objetivo entregar fármacos pouco solúveis as células, além de terem a habilidade de entrar passivamente via aumento de permeabilidade e retenção das células tumorais aumentando assim a biodisponibilidade e acúmulo do fármaco nas células de interesse, diminuindo efeitos adversos causados por quimioterápicos. A Salinomicina (SAL) é um antibiótico isolado de Streptomyces albus que recentemente mostrou ser um novo candidato ao tratamento de cancro por inibir seletivamente células estaminais presentes no cancro responsáveis pelo ressurgimento da doença e resistência aos fármacos quimioterápicos.Objetivos: O objetivo principal deste estudo é o design de micelas poliméricas (PM) para distribuição de SAL para células cancerígenas e sua caracterização em termos de diâmetro médio (MD), carga de superfície (ZP) e índice de poli dispersão (PDI). A capacidade de encapsulaçao de MP SAL é determinada e sua eficácia in vitro em relação ao modelo NSCLC foi avaliada e comparada com a atividade livre do fármaco.Métodos: A formação de micelas foi feita pela técnica de reidratação de filme, onde o solvente orgânico contendo uma mistura de fármaco e polímero é evaporado a fim de formar um filme polimérico. Esse filme então é reidratado com água e agitado e há a formação de micelas. Ensaios in vitro como MTT, wound healing e imunocitoquímica foram realizados em triplicata com cultura celular em placas de 96 e 24 poços seguidos de tratamentos com fármaco livre (SAL), fármaco encapsulado (PM SAL) em micelas bem como micelas vazias (Plain PM) em diferentes tempos de incubação. Para a imunocitoquímica, anticorpos anti Pg-p e Vimentina foram utilizados a fim de observar no microscópio de fluorescência os níveis de expressão destas proteínas.Resultados: A caracterização das micelas confirmou que o polímero utilizado foi capaz de formar micelas com tamanhos e índice de poli dispersão esperados (<100nm e < 0,4 respectivamente) já o potencial zeta foi diretamente alterado a medida que a concentração de polímero aumentava, ou seja, quanto maior a concentração de polímero mais próximo da neutralidade a carga de superfície. Para os resultados de MTT, SAL em sua forma não encapsulada mostrou ter efeito dose e tempo dependente em células de cancro de pulmão após 48 horas e além disso, mostrou ser mais eficaz do que em sua forma encapsulada.Nos ensaios de invasão celular (wound healing) SAL e PM SAL mostraram efeitos semelhantes na retenção de migração celular após 24 horas. Nos resultados de imunocitoquímica, SAL e PM SAL mostraram resultados muito semelhantes em inibir a expressão de Pg-p. Por fim, quanto a expressão de vimentina, pode-se observar que quando a concentração de fármaco foi aumentada para 20 uM, houve uma diminuição mais acentuada da expressão de vimentina nas células tratadas com PM SAL. Conclusão: As micelas poliméricas apresentaram as características propostas para a entrega de SAL. Nos ensaios de viabilidade celular, não demonstraram ter efeito citotóxico mais acentuados do que em sua forma livre, porém as PM SAL resistiram ao processo biológico e sua eficácia foi demonstrada na inibição da migração celular, na evasão da Pg-p e inibição da vimentina. Isto indica que as PM SAL podem ser um eficiente coadjuvante no tratamento de NSCLC. Estudos posteriores serão necessários mais para entender melhor a internalização das micelas assim como se faz necessária a funcionalização com anticorpos para que as micelas sejam direcionadas para as células de interesse.Introduction: The approach of using nano medicine to treat several diseases, for cancer has been increasingly used and studied to overcome the barriers found in conventional therapy. The use of the non-toxic amphiphilic polymer such as Pluronic F127 for the formation of nano particles brings great advantages by forming micelles of biologically active substances with sizes from 10 to 100 nm. This technique aims to deliver poorly soluble drugs to the cells, in addition to achieve the ability to passively enter via enhanced permeability and retention (EPR) of tumour cells thereby increasing the bioavailability and accumulation of the drug in the cells of interest, decreasing adverse effects caused by chemotherapeutics. Salinomycin (SAL) is an isolated Streptomyces albus antibiotic that has recently been shown to be a new candidate for cancer treatment by selectively inhibit cancer stem cells responsible for disease resurgence and resistance to chemotherapeutic drugs.Objectives: The main goal of this study is the design of polymeric micelles (PM) for SAL delivery to cancer cells and their characterization in terms of medium diameter (MD), surface charge (ZP) and poly dispersion index (PDI). MP SAL loading capacity is determined and it’s in vitro in effect against NSCLC model was assessed and compared with the free drug activity.Methods: The preparation of micelles was done by the film rehydration technique, where the organic solvent containing a mixture of drug and polymer is evaporated to form a polymer film. This film is then rehydrated with water and vortex to form micelles. In vitro assays such as MTT, wound healing and Immunocytochemistry were performed in triplicate with cell culture in 96 and 24 plates followed by treatments with free drug (SAL), encapsulated drug (PM SAL) in micelles and empty micelles (Plain PM) in different incubation time points. For immunocytochemistry, anti-Pg-p and vimentin antibodies were used to observe the levels of expression of these proteins in the fluorescence microscope.Results: The micelles characterization confirmed that the polymer was able to form micelles with expected MD and PDI (<100nm and