Terapia baseada em exossomas para o acidente vascular cerebral

Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaStroke is defined as a neurological deficit attributed to an acute focal injury of the central nervous system. Despite the advances in prevention and treatment, stroke is the second cause of mortality around the world and the patients that survive have high morbidity. Currently, there is only one FDA-approved drug available for the treatment of acute ischemic stroke, the tissue plasminogen activator (tPA). So far, there is no available treatment to increase the survival of neural cells and to rapidly stimulate angiogenesis and neurogenesis in the ischemic brain. Among the researched therapies, cell-based therapies have shown a recovery potential of central nervous system by promoting neuroplasticity, angiogenesis and immunomodulation. These effects are not directly related to the transplanted cells but with the paracrine effect of these cells. Thus, interests in exosomes have emerged recently since they are considered the major active factor that mediates restorative effect.This work can be divided in two parts, mainly the isolation of exosomes from MNCs and WJ-MSCs, and the assessment of their bioactive role over three important cell types in ischemic stroke recovery.We properly isolated exosomes with a circular shape and median size of 130 nm (MNC-exosomes) and 150 nm (WJ-MSC-exosomes). Moreover, both were positive for exosomal-enriched proteins CD9 and CD63 and also for specific marker from progenitor cells, proving not only their essence, but also their origin. In HUVECs and cortical neurons, WJ-MSC-exosomes are internalized at a higher rate than MNC- exosomes, with 100% of uptake after 24 hours contrasting with around 70% for MNC- exosomes. Both exosomes were able to induce survival of HUVECs subjected to oxygen and glucose deprivation, whereas, just MNC-exosomes could increase the resistance of neurons to the same stimuli. Although we demonstrate an increased amount of the neuroprotective miR-223-3pin MNC-exosomes (35 times more than in WJ-MSC-exosomes), we were not able to prove a reduction in GluN2B expression, displacing the hypothesis that this micro RNA could be increasing neuronal survival through GluN2B signaling pathways. Both exosomes were able to induce phenotypic changes over neural stem cells (NSC), however only MNC-exosomes induced avmeaningful production of new neurons. Taking together, these results reveal the potential of MNC- and WJ-MSC-exosomes over three important steps for stroke recovery, mainly neurovascularization, neuroprotection and neuroregeneration.Acidente vascular cerebral (AVC) é definido como uma patologia neurológica atribuída a um incidente no sistema nervoso central. Mesmo com todos os avanços na prevenção e tratamento, AVC ainda é mundialmente a segunda maior causa de morte e pacientes que sobrevivem apresentam alta taxa de morbilidade. Atualmente, só o ativador de plasminogênio tecidual (tPA) está aprovado pela FDA como tratamento para o AVC isquémico. Neste momento, não existem tratamentos clinicamente disponíveis para aumentar a sobrevivência de células neuronais ou estimular a formação de novos vasos sanguíneos na região afetada. De entre as várias tentativas para encontrar um tratamento, terapias baseadas em células mostraram potencial na indução de neuroplasticidade, formação de novos vasos sanguíneos e modulação do sistema imune. Os efeitos observados parecem não estar diretamente relacionadas com a transplantação celular, mas sim com o seu efeito parácrino. Desta forma, o interesse sobre o uso de exossomas tem crescido exponencialmente, pois estes são considerados um dos fatores mais importantes na mediação dos efeitos terapêuticos observados.O trabalho aqui apresentado dividiu-se em duas etapas, o isolamento e caracterização de exossomas a partir de células mononucleares (MNC-exosomes) e de células estaminais mesenquimais (WJ-MSC-exosomes), ambas provenientes do sangue e cordão umbilical, respectivamente.Foi possível isolar apropriadamente exossomas que apresentam uma forma circular e diâmetro com mediana de 130 nm (MNC-exosomes) e 150 nm (WJ-MSC- exosomes). Além disso, ambos apresentaram positividade para CD9 e CD63, proteínas enriquecidas em exossomas, e de forma interessante, também se mostraram positivos para marcadores específicos das células progenitores, provando não só a sua essência, mas também a sua origem. Em HUVECs e neurónios do córtex, WJ-MSC-exosomes foram internalizados mais rapidamente do que os MNC-exosomes, com cerca de 100% de internalização no final de 24 horas, contrastando com em torno de 70% observado para a segunda população. Ambos os exossomas são capazes de promover a sobrevivência de HUVECs sujeitas aviiprivação de oxigénio e glucose, no entanto apenas exossomas de MNCs foram eficazes a aumentar a resistência dos neurónios após o estímulo. Embora tenhamos provado que o miR-223-3p considerado neuroprotector está 35 vezes mais presente em MNC-exosomes do que em WJ-MSC-exosomes, não observámos uma redução na expressão de GluN2B, colocando de parte a hipótese que este micro RNA poderia ser o mecanismo de ação para as diferenças observadas entre os tratamentos. Ambas as populações de exossomas foram capazes de induzir alterações no fenótipo de células estaminais neurais (NSC), no entanto apenas exossomas provenientes de MNC conseguiram aumentar notoriamente a quantidade de novos neurónios formados. Os dados aqui presentes revelam o potencial de exossomas provenientes de MNC e de WJ-MSC sobre três importantes pilares da recuperação de um AVC.Universidade de Coimbra - Financiamento de produtos laboratoriais essenciais para a correcta execução dos procedimentos. Projecto StrokeTherapy atribuido ao Doutor Lino Ferreira