Cogumelos comestíveis como mediadores da sustentabilidade e saúde humana

Dissertação de Mestrado em Biodiversidade e Biotecnologia Vegetal apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaOs cogumelos são cada vez mais reconhecidos como alimentos relevantes, devido aos seus benefícios nutricionais e compostos bioativos. Tanto os cogumelos silvestres como os cogumelos cultivados apresentam atividades biológicas importantes, entre as quais antioxidante, hipolipídica, hipoglicémica e hepatoprotetora. A doença do fígado gordo não alcoólico (FGNA) é caracterizada pela acumulação de lípidos nos hepatócitos na ausência de consumo excessivo de álcool, sendo considerado um problema de saúde pública, que afeta 20 a 35% das pessoas a nível mundial e causa cerca de 2% das mortes por ano. Apesar de não serem conhecidos totalmente os mecanismos celulares envolvidos na doença, sabe-se que as mitocôndrias são importantes mediadores subcelulares nos distúrbios hepáticos e na progressão da doença, estando envolvidas em várias vias metabólicas, como na homeostasia lipídica e no aumento de espécies reativas de oxigénio (ROS), que pode conduzir a um défice na atividade bioenergética mitocondrial e a comprometer a recuperação dos hepatócitos. Várias espécies de cogumelos apresentam efeitos positivos nos níveis lipídicos do sangue e do fígado, apresentando-se assim como uma estratégia promissora no tratamento de FGNA e outros distúrbios metabólicos. No entanto, os efeitos metabólicos dos cogumelos e dos seus compostos bioativos nos mecanismos celulares ainda não são inteiramente compreendidos.Este estudo teve como objetivo principal avaliar o possível efeito hepatoprotetor de três cogumelos, a espécie medicinal reishi (ou linghzi, Ganoderma lucidum (Curtis: Fr) P. Karst., e duas excelentes comestíveis, o tortulho (Boletus edulis Bull.) e o frade (Macrolepiota procera (Scop.)) Singer, com interesse na função e viabilidade mitocondrial.Em primeiro, foi avaliado o efeito citotóxico dos três extratos etanólicos dos cogumelos na linha celular derivada de hepatócitos humanos (HepG2), para estimar as concentrações seguras, ou seja, as concentrações não tóxicas para as células. Em segundo, pretendeu-se otimizar e validar um modelo in vitro de citotoxicidade de ácido palmítico (PA), avaliando-se a citotoxicidade do PA nas células HepG2, tendo em conta o efeito deste ácido gordo em vários ensaios celulares. Os efeitos na atividade bioenergética celular e mitocondrial na presença dos cogumelos e do PA (com e sem frutose) foram estimados utilizando diferentes ensaios, avaliando a atividade metabólica (ensaio de redução da resazurina), a massa celular (ensaio de sulforodamina B), concentração de ATP (por luminescência), ROS (MitoSOX) e apoptose celular (coloração com Hoechst). As concentrações selecionadas de cogumelos foram então usadas para prevenir a toxicidade do PA em células HepG2, de forma a obter evidências preliminares do seu potencial efeito protetor em doenças hepáticas.Os resultados demonstraram que os extratos etanólicos dos cogumelos apresentam pouca toxicidade na alimentação, sendo que ao nível celular/mitocondrial, somente apresentaram toxicidade em concentrações superiores a 250 μg/mL para o G. lucidum, 750 μg/mL para o M. procera e 1000 μg/mL para o B. edulis, comprovando a segurança associada ao consumo das três espécies.Em relação ao modelo de citotoxicidade com PA, através dos diferentes ensaios, foi definido como EC50, 500 μM. Seguidamente, foi avaliado o efeito dos cogumelos no modelo de citotoxicidade com PA, G. lucidum (62,5 μg/mL) contribuiu para um ligeiro aumento na atividade metabólica e os extratos de B. edulis e M. procera apresentaram efeitos semelhantes. A combinação dos extratos de G. lucidum com M. procera (62,5 μg/mL + 125 μg/mL) parece prevenir a citotoxicidade PA. No entanto, os resultados revelam que os cogumelos não apresentaram um efeito protetor estatisticamente significativo na citotoxicidade causada pelo PA. Os resultados indicam que G. lucidum, B. edulis e M. procera não conseguiram prevenir a possível hepatotoxicidade resultante da acumulação de gordura no fígado. Similarmente, foram obtidos resultados negativos com o resveratrol, um reconhecido polifenol com atividade antioxidante. Os ensaios in vitro sugerem que a citotoxicidade causada pelo PA pode exceder o ponto de não retorno, limitando assim a proteção dos diferentes agentes. Ainda assim, os nossos resultados suportam uma futura validação a validação futura de extratos naturais dietéticos e fitoquímicos isolados, com o objetivo de diminuir o fenótipo associado à doença do fígado gordo.Mushrooms are increasingly recognized as important foodstuffs for their nutritional benefits and bioactive compounds. The biological activities are present in both wild and cultivated mushrooms and include antioxidant, hypolipidemic, hypoglycemic, and hepatoprotective activities, among others. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is characterized by hepatic lipid accumulation in the absence of excess alcohol intake and is a major public health issue, affecting 20–35% of people in the world and accounting for about 2% of deaths annually. Despite the cellular mechanism not fully understood, it is well known that mitochondria are the sub-cellular mediators on liver disorder and disease progression, being involved on several metabolic pathways such as lipid homeostasis and increases in reactive oxygen species (ROS), which may, in turn, lead to a mitochondrial bioenergetics deficit and compromise hepatocyte recovery. Several mushroom species positively affect blood and liver lipid levels, and can thus be a promising strategy in the treatment of NAFLD and other metabolic disorders. However, cellular mechanisms underlying metabolic effects of mushrooms, and respective bioactive compounds, are not thoroughly understood.The main goal of this study was to investigate the possible hepatoprotective effect of the medicinal species reishi (or Linghzi, Ganoderma lucidum (Curtis: Fr) P. Karst.) and the two edible mushrooms porcini (Boletus edulis Bull.), and “parasol mushroom” (Macrolepiota procera (Scop.) Singer), with a particular focus on mitochondrial function and how mushrooms may improve hepatic function.First, the cytotoxic effect of the three mushroom ethanolic extracts was evaluated in human hepatocytes-derived (HepG2) cell line in order to estimate the safe concentration window, i.e. the mushroom concentrations that are not toxic to cells. Second, the cytotoxicity of palmitic acid (PA) in HepG2 cells was estimated through the effect of this fatty acid on several cellular end points to optimize and validate a PA cytotoxicity-induced model in vitro. The cytotoxic effects of PA (without and with fructose), and mushrooms on cellular and mitochondrial bioenergetics function were estimated using different end-points: metabolic activity (resazurin reduction assay), cell mass (sulforhodamine B assay) and ATP concentration (luminescent cell viability assay), ROS (mitochondrial superoxide anion detection using MitoSOX), and nuclear fluorescence staining (Hoechst). The selected concentrations of mushrooms were then used in order to prevent PA toxicity on HepG2 cells, in order to obtain preliminary evidence of their potential protective effect on liver diseases.The results demonstrated that all mushroom ethanolic extracts showed little toxicity; in fact, cellular/ mitochondrial toxicity was observed only at concentrations higher than 250 μg/mL for G. lucidum, 750 μg/mL for M. procera and 1000 μg/mL for B. edulis, supporting the safety associated to the consumption of the three species. Regarding the PA cytotoxicity model, through the different end points, was defined as EC50 500 μM. Then, the PA toxicity model was tested with the mushrooms, Ganoderma lucidum (62.5 μg/mL) contributed to a slight increase on metabolic activity and B. edulis and M. procera extracts presented similar profiles. The combination of G. lucidum with M. procera extracts (62.5 μg/mL + 125 μg/mL) seems prevent the PA cytotoxicity. However, there was no statistically significant protection of the mushroom extracts used on the end-points for cytotoxicity caused by PA. Our data does not support the use of G. lucidum, B. edulis and M. procera to prevent possible hepatotoxicity resulting from liver overload. Similar negative results were obtained with resveratrol, a polyphenol recognized for its antioxidant activity. The results from the in vitro assays suggested that the cytotoxicity caused by PA may exceed a point of-no return, thus limiting the protection by different agents. Still, our data supports the future validation of dietary natural extracts and isolated phytochemicals in order to decrease the phenotype associated with fatty liver disease