Study of post mortem metabolic changes in the liver by NMR spectroscopy

Dissertação de Mestrado em Química Forense apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaThe estimation of the post mortem interval is an important task in a medico-legal investigation. This determination is crucial in homicide cases, since it can lead to the identification or elimination of a suspect. The conventional methods that are used for determining time since death are mostly based on physical changes and decomposition artefacts of the corpses. These changes are extremely affected by both internal and external conditions and thus the chance of producing erroneous results is high. However, death also results in metabolic changes in the tissues of the deceased. The study of these changes could lead to the identification of new biomarkers for a more accurate estimation of the post mortem interval. In the present study, liver samples of twenty mice (Mus musculus), ten males and ten females, were collected immediately after death and 2, 6, 24, 48 and 72 hours after death. The aim was to analyse the metabolic changes by HR-MAS NMR spectroscopy and identifying potential post mortem interval biomarkers. Six NMR spectra were obtained per mouse liver, one per each time of sample collection, as such, a large amount of data was obtained. All spectral data were processed and subjected to a multivariate statistical analysis.The results of principal component analysis (PCA) allowed to verify significant differences between the metabolic profiles of samples collected at 0, 6, 24 and 48 hours after death in both sexes. It was possible to observe changes of lipids, lactate and glucose. From the analysis of the spectra, was possible to identify an increase in lactate and glucose levels over time, after death, exposing these metabolites as potential post mortem biomarkers. The presented results showed that a metabolic analysis of biological tissues by HR-MAS NMR spectroscopy is a potential valid approach for a more precisely estimation of post mortem interval.A determinação do intervalo post mortem é um dos aspetos mais importantes numa investigação médico legal, tendo maior relevância em casos de homicídio, visto que possibilita a identificação ou eliminação de suspeitos. Os métodos convencionais para a determinação do tempo após a morte baseiam-se, maioritariamente, nas alterações físicas e nos fenómenos de decomposição do cadáver. Estes são bastante afetados tanto pelas condições internas como externas, o que faz com que a probabilidade de ocorrerem erros na estimativa do intervalo post mortem seja muito elevada. No entanto, a morte resulta também em alterações metabólicas nos tecidos do cadáver. O estudo destas alterações poderá levar à identificação de novos biomarcadores para uma estimativa mais precisa da hora da morte. No presente estudo, foram recolhidas amostras de fígado de 20 murganhos, 10 machos e 10 fêmeas, da espécie Mus Musculus, imediatamente após a morte e 2, 6, 24, 48 e 72 horas depois, com o objetivo de analisar as alterações metabólicas e identificar possíveis biomarcardores úteis na determinação do intervalo post mortem, usando HR-MAS NMR. Foram obtidos 6 espectros de RMN por fígado de murganho, um por cada tempo de recolha de amostra, tendo-se obtido uma grande quantidade de dados, os quais foram todos processados e submetidos a uma análise estatística multivariada. Os resultados da Análise de Componentes Principais (PCA) permitiram verificar diferenças significativas entre os perfis metabólicos relativos a amostras recolhidas 0, 6, 24 e 48 horas após a morte nos dois sexos, tendo-se observado alterações a nível dos lípidos, do lactato e da glucose. A partir da análise dos espectros, observou-se um aumento da concentração do lactato e glucose com o tempo após a morte, indicando, assim, que estes metabolitos apresentam ser biomarcadores post mortem promissores. Estes resultados mostraram que uma análise metabolómica de tecidos biológicos através de espectroscopia de HR-MAS NMR é uma abordagem promissora para a determinação do intervalo post mortem de um modo mais preciso