Impacte da bactéria patogénica - Pseudomonas syringae pv. actinidiae no microbioma de actinídia

Dissertação de Mestrado em Biodiversidade e Biotecnologia Vegetal apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaNos últimos anos, a produção de kiwi diminuiu devido a surtos de Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa), o agente causador do cancro bacteriano em plantas em Actinidia tornando-se uma doença pandémica que ameaça a sustentabilidade da indústria do kiwi nos principais países produtores, incluindo Portugal.Para entender o impacto da Psa na comunidade microbiana de Actinidia deliciosa, o microbiota das folhas foi caracterizado em pomares saudáveis e com doença. Pretendeu-se eliminar fatores que poderiam alterar o microbiota entre as amostras. Desse modo, as folhas de A. deliciosa foram recolhidas de plantas de pomares vizinhos, removendo assim a influência de condições abióticas na estrutura do microbiota. Além disso, ambos os pomares praticava-se agricultura biológica, sem aplicação de substâncias químicas, evitando a seleção artificial de populações de bactérias com base na sua resistência a pesticidas. Com esta abordagem, as alterações identificadas no microbiota entre plantas saudáveis e doentes permitirá avaliar o real impacto da doença e identificar grupos de microrganismos com aplicação potencial na modulação da doença e no estado de saúde da planta. A diferença na susceptibilidade a Psa entre as plantas femininas e masculinas de A. deliciosa é bem conhecida. Desse modo, também foi nosso objetivo determinar se a estrutura do microbiota de entre plantas femininas e masculinas pode desempenhar um papel nessa característica, abrindo o caminho para a descoberta de novos agentes de prevenção / controle contra Psa.Duas metodologias foram aplicadas para determinar a composição estrutural do microbiota, métodos dependentes e independentes de cultivo, já que pretendemos não só construir uma coleção de cultura de microrganismos que poderiam ser usados em estudos futuros, mas também obter uma “imagem instantânea” e detalhada da estrutura do microbiota. A combinação destas duas metodologias permitiu uma análise detalhada da diversidade estrutural do microbiota associada ao estado fitossanitário de A. deliciosa.Em ambas as abordagens foram identificados três filos predominantes tanto em pomares saudáveis como doentes, Proteobacteria, Actinobacteria e Firmicutes, mas com abundância relativa distinta entre as amostras. Além disso, observou-se que as plantas masculinas tendem a apresentar maior diversidade do que as plantas femininas (valores mais pronunciados nos resultados obtidos por métodos independentes de cultivo), sendo essa diferença mais óbvia em plantas doentes.Em geral, a Psa induziu uma alteração dramática na estrutura da microbiota das folhas, traduzida em maior diversidade apesar do domínio do filo Pseudomonadales. Em ambas as abordagens (métodos dependentes de cultivo independentes de cultivo), a existência de populações bacterianas potencialmente fito-patogénicas foi observada em amostras de pomares doentes, isto é, populações pertencentes aos géneros Pseudomonas, Serratia, Pantoea, Erwinia e Escherichia-Shigella, entre outras. Os resultados globais fornecem evidências de que, embora a Psa seja a causa do cancro bacteriano nas plantas de kiwi, a presença de outras populações patogénicas também pode contribuir para a doença e declínio das plantas afetadas.Este estudo permitiu um avanço na compreensão da estrutura e composição das comunidades bacterianas em Actinidia deliciosa e determinou ainda o impacto de Psa no microbiota.In last years the kiwifruit production decreased due to outbreaks of Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa), the causative agent of the bacterial canker of kiwifruit, becoming a pandemic disease threatening the sustainability of the kiwi industry in major producing countries, including Portugal.In order to understand the impact of Psa in the microbial community of Actinidia deliciosa, the microbiota of leaves was characterized from healthy and disease orchards. We intended to eliminate possible factors that could alter the microbiota between samples. In accordance, the studied A. deliciosa leaves were collected from plants in neighbor orchards removing the influence of abiotic conditions in the microbiota structure. Moreover, both orchards were organic, with no applied chemicals avoiding, once more, the artificial selection of bacterial populations based on their resistant to pesticides. With this approach, the identified alteration on the microbiota between heath and disease plants will allow assessing the impact of the disease and identify groups of microorganisms with a potential role on the modulation of the disease or on the plant health status to be used in the near future. Difference on the susceptibility to Psa between A. deliciosa females and males plants is well known. In accordance, it was also our goal determine if the microbiota structure of females and males may play a role on this feature, paving the way to the discovery of new preventing/controlling agents against Psa. Two methodologies were applied to determine the microbiota structural composition, namely culture–dependent and culture-independent methods since we intended, not only to construct a culture collection of microorganisms that could be used in future studies, but to get a detailed snapshot of the “total” microbiota. The combination of these two methodologies allowed a detailed analysis of the microbiota structural diversity associated with the phytossanitary status of A. deliciosa. In both approaches, three predominant phyla were identified in both healthy and diseased orchards, Proteobacteria, Actinobacteria and Firmicutes, but with distinct relative abundance among sample. Additionally, it was observed that male plants tend to have higher diversity than female plants (more pronounced on culture-independent methods results), being this difference more obvious on diseased plants. Overall, Psa induced a dramatic alteration on the structure of leaves microbiota in both approaches, translated in increased diversity despite the dominance from Pseudomonadales order. In both approaches (culture -dependent and -independent methods) the existence of putative phytopathogenic bacterial populations was observed in diseased orchards samples, i.e. populations belonging to genera Pseudomonas, Serratia, Pantoea, Erwinia and Escherichia-Shigella, among others. The overall results provide evidence that, although Psa is the cause of kiwifruit bacterial canker, the presence of other pathogenic populations may also contribute for the disease and aid on the deteriorating condition of the diseased plant. This study has enabled a breakthrough in understanding the structure and composition of bacterial communities in Actinidia deliciosa and determined the impact of Psa in the plant leaves microbiota