Photodynamic therapy applied to asepsis of root canals

Tese de doutoramento em Ciências da Saúde, no ramo de Medicina Dentária, na especialidade de Dentisteria Operatória (Endodôncia), apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de CoimbraA antissepsia efetiva do sistema de canais radiculares é indubitavelmente uma etapa fundamental no sucesso do tratamento endodôntico, tratamento este que visa preservar as condições de assepsia ou eliminar os microrganismos do interior dos canais radiculares, promovendo a manutenção ou o restabelecimento da integridade dos tecidos periapicais. As condições de assepsia, obtidas durante a fase de preparação biomecânica, devem ser preservadas com a realização da obturação tridimensional do sistema canalar, seguida da restauração coronária. São várias as técnicas contemporâneas da preparação canalar existentes que incluem obrigatoriamente um desbridamento químico-mecânico, dando preferência a um sistema de Endodontia rotatório mecanizado de niquel-titânio combinado com soluções de irrigação, das quais o hipoclorito de sódio se destaca como o goldstandard atendendo às suas propriedades antibacterianas e proteolíticas na dissolução dos tecidos orgânicos. Contudo, são vários os estudos que verificam que com as presentes técnicas e materiais disponíveis, a total erradicação de microrganismos do sistema canalar ainda não é possível. Na pesquisa por novos métodos na desinfeção canalar, a irrigação ativada por LASER (PIPS) e a terapia fotodinâmica (PDT) destacam-se das demais. Ao passo que as PIPS promovem o desbridamento do sistema canalar com o LASER Er:YAG em níveis de potência sub-ablativos, a PDT resulta da combinação de um agente inerte (fotossensibilizador) com uma fonte de luz (LASER de baixa potência) que, na presença de oxigénio, absorve fotões de luz e com o aumento do período de irradiação, os eletrões passam a um estado energético cada vez mais elevado, mas instável. Os eletrões ao regressarem ao seu estado basal, libertam energia, que é transferida ao substrato sob a forma de radicais livre de oxigénio altamente reativos que possibilitam a eliminação de microrganismos, sem indução de resistência microbiana e dano no hospedeiro. A PDT tem apresentado, nos estudos experimentais um franco crescimento com resultados promissores e é economicamente mais acessível ao Endodontista do que as PIPS. O objetivo principal do presente trabalho foi avaliar a eficácia antimicrobiana da PDT com vários fotossensibilizadores, em particular uma clorofila modificada derivada do complexo de zinco(II) de éster trimetílico da clorina e6, Zn(II)e6Me, extraída da clorofila a, um novo fotossensibilizador aplicado à Endodontia versus irrigantes clássicos. Para a concretização deste estudo, foram preparados biofilmes de Enterococcus faecalis e Candida albicans mono- e multiespécies em superfícies abióticas experimentais (lamelas de vidro); discos de dentina e blocos radiculares obtidos a partir de dentes humanos. Na primeira parte do trabalho experimental, realizou-se um estudo piloto para selecionar os agentes antimicrobianos mais eficientes. Em biofilmes de 48 h, mono- e multiespécies, foram aplicados três irrigantes clássicos; hipoclorito de sódio (NaOCl) a 3%, ácido etileno-diamino-tetra-acético (EDTA) a 17% e clorhexidina (CHX) a 2%; em três períodos de contacto diferentes (60, 90 s e 30 min). Nos grupos de PDT, testaram-se nos mesmos biofilmes quatro fotossensibilizadores, todos à mesma concentração de 0,1 mg/mL. Azul de toluidina-O (TBO), rosa bengala (RB), a porfirina catiónica sintética de tetraiodeto de 5,10,15,20-tetraquis(1-metilpiridinio-4-il)porfirina (TMPyP) e a clorofila modificada (Zn(II)e6Me) em dois períodos de tempo (60 e 90 s). Em resultado destes ensaios, concluiu-se que o período de tempo de 90 s é suficiente para obtermos resultados antimicrobianos de excelência, não sendo necessário alongar o mesmo até 30 min nos irrigantes clássicos, sendo este período descartado nos estudos seguintes. A clorofila modificada, Zn(II)e6Me, em condições in vitro quando ativada por LED em períodos de 60 a 90 s conseguiu eliminar cerca de 60% de biomassa de biofilme, sendo mais eficiente do que TBO e RB e similar à TMPyP, CHX e EDTA. NaOCl apresentou uma eficiência superior, quando comparado com a clorofila modificada, com 70-90% de remoção de biomassa de biofilme. Várias técnicas de microscopia óptica, de fluorescência confocal e eletrónica de transmissão mostraram a morfologia e ultra-estrutura dos biofilmes e permitiram aferir a eficácia antimicrobiana nos grupos de PDT com os vários fotossensibilizadores. Por microscopia eletrónica de transmissão, nos biofilmes expostos a NaOCl, foi possível perceber que ocorreu uma quase total destruição do biofilme, pois não se conseguiu biomassa suficiente para analisar. Na segunda parte do trabalho experimental, avaliámos a citotoxicidade e comparámos o efeito antimicrobiano da clorofila modificada, Zn(II)e6Me, na mesma concentração (0,1 mg/mL) com o Fotosan, fotossensibilizador disponível comercialmente, e com o melhor irrigante clássico, 3% NaOCl quando aplicados a discos de dentina e blocos radiculares infectados com biofilmes mistos de 48 h de E. faecalis e C. albicans. As principais conclusões identificadas nos discos de dentina foram que a clorofila modificada quando irradiada por 90 s alcançou uma eficiência antimicrobiana de 59,13%, ultrapassada pelo NaOCl (68,12%). Contudo, quando o período de irradiação é alargado dez vezes, dos 90 para os 900 s, a eficácia de Zn(II)e6Me aumenta para 70,88%, ao passo que o aumento do período de contacto directo nos agentes clássicos não potencia a sua eficácia antimicrobiana. Nos blocos radiculares, a clorofila modificada apresenta o melhor resultado antimicrobiano aos 90 s (79,74%) e aos 300 s (81,72%), seguido de perto por 90 s de NaOCl (75,5%). De salientar, que o padrão de desinfeção antimicrobiano é consistente nos grupos da clorofila modificada, o que não se verifica no exposto a NaOCl. Nos testes de citotoxicidade, a clorofila modificada não induz qualquer citotoxicidade. Contrariamente, nas imagens de microscopia confocal, há um aparente reforço estrutural dos fibroblastos, quando comparado com o grupo controlo. Como conclusão final deste trabalho pode afirmar-se que a clorofila modificada, por se ter revelado um fotossensibilizador com resultados estatisticamente semelhantes, em termos de eficácia antimicrobiana, ao que é considerado como o melhor método de assepsia do canal radicular, o hipoclorito de sódio a 3%, mas isenta de citotoxicidade, apresenta um elevado potencial para uma aplicação futura em Endodontia.Root canal asepsis is one of the most important goals for a successful endodontic treatment, focused on microorganisms removal from the root canal system, aiming to maintain or re-establish the integrity of the periapical tissues. The endodontic treatment procedure comprises the establishment of an aseptic environment, biomechanical root canal preparation to restrain microorganisms, three-dimensional filling of the root canal system to resist potential microbial ingress, and a coronal restoration to prevent microleakage in the long-term. Current techniques include the root canal system mechanical debridement and shaping with emphasis on various nickel-titanium (NiTi) rotary systems and endodontic irrigant solutions with sodium hypochlorite (NaOCl) considered the goldstandard because of its antibacterial and tissue dissolution properties. Nevertheless, numerous studies have verified that complete microorganisms eradication from the root canal system cannot be consistently achieved with none of the currently endodontic techniques. In search of new methods to provide additional disinfection to the root canal system and presumably improve treatment outcome, novel techniques including PIPS (Photon Induced Photoacoustic Streaming) and photodynamic therapy (PDT), both standing out as the most promising. PIPS is a revolutionary method for cleaning and debriding the root canal system using Er:YAG LASER energy at sub-ablative power levels, to create photoacoustic shock waves. Antimicrobial PDT (aPDT) is an approach that uses a nontoxic agent, photosensitizer (PS), that is selectively absorbed in a target tissue and when activated with a low-intensity light source, in the presence of oxygen, a series of reactions produce free radicals and singlet oxygen molecules leading to microorganisms eradication with no microbial resistance induced and host damage. aPDT has been a fast-growing approach at experimental studies with promising results and economically is more accessible to Endodontists when compared to PIPS. In this study, the main goal was to assess the efficacy of aPDT with a modified chlorophyll, Zn(II)chlorin e6 methyl ester, Zn(II)e6Me, extracted from chlorophyll a, as a new PS activated by red light versus endodontic classical irrigants. In the first part of this experimental study, it was performed a screening to obtain the best antimicrobial agents. For this, Zn(II)e6Me was compared with Rose Bengal (RB), Toluidine Blue-O (TBO), the synthetic tetracationic porphyrin (TMPyP) for 60 and 90 s all at the same concentration of 0.1 mg/mL, as well as classical endodontic irrigants (3% NaOCl, 17% EDTA and 2% CHX) for 60, 90 s and 30 min all applied to monospecies and mixed biofilms of Enterococcus faecalis and Candida albicans. The main conclusions obtained were that the direct contact time period of 90 s is sufficient to obtain optimal antimicrobial outcomes. It is not necessary to increase it up to 30 min in classical irrigants; for this reason this period was discarded in the following research. Zn(II)e6Me once activated with light for 60 or 90 s was able to remove around 60 % of the biofilm’s biomass, similar to TMPyP and classical irrigants, CHX and EDTA. Zn(II)e6Me was more efficient than TBO and RB. NaOCl revealed higher efficacy, with 70-90% of the biofilm’s biomass removal. In the microscopy images (optical, confocal and transmission) it was possible to visualize the biofilms and to make a qualitative evaluation of the antimicrobial results with the respective images in the PDT groups. Nevertheless, in transmission microscopy, it was not possible to visualize the NaOCl group, because, due to the extensive destruction of cells, the biomass in the pellet was not enough to proceed. In the second part of the experimental work, the Zn(II)e6Me cytotoxic outcomes and antimicrobial efficacy were calculated and compared to FotoSan®, the commercially PS avaiable in the dentistry market as well the best classical irrigant solution, 3% NaOCl all applied to dentin discs and root blocks infected with 48h mixed biofilms of E. faecallis and C. albicans. The main conclusion at dentin discs identified were for the time period of 90 s, classical irrigant 3% NaOCl revealed the best antimicrobial outcome (68.12%), followed by Zn(II)e6Me (59.13%). Nevertheless, after irradiation time of 900 s, Zn(II)e6Me has a biofilm removal outcome of 70.88%. In root dentin blocks, Zn(II)e6Me has the best antimicrobial approach at 90 s (79.74%) and 300 s (81.72%), followed by 3% NaOCl (75.5%) and the antisepsis pattern was consistent at inner and outer samples for aPDT group. No cytotoxic outcomes were detected for the modified chlorophyll, Zn(II)e6Me, at 24 and 48 h and at confocal microscopy images it was observed an apparent structural reinforcement of fibroblasts cytoskeleton, when compared to the control group. As a general conclusion, it can be claimed that the modified chlorophyll presented asepsis efficacy similar to 3% of sodium hypochlorite, but with no cytotoxicity, revealing potential future application in endodontics