Peripheral nerve regeneration – development and evaluation of biodegradable polymers guide-tube

Tese de doutoramento em Materiais e Processamento Avançados (AdvaMTech), apresentada ao Departamento de Engenharia Mecânica da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraThe main goal of this PhD work was the development and evaluation of novel nerve guide conduits based on biocompatible and biodegradable polymers for regenerative medicine, namely peripheral nerve regeneration. The injury of the peripheral nerves are a quite common, especially in the young male population due to accidental traumatic events. The degree of injury may vary, being the most severe cases associated with permanent disability. Since the last century, new strategies to improve peripheral nerve regeneration after injury have been studied. The first technique proposed and still nowadays showing the best results is the use of nerve autograph. Nevertheless, this technique is associated to some disadvantages, which include the need of two surgeries and site morbidity. In this sense, nerve guide conduits, which consist in hollow tubes that are sutured to both nerve ends have been proposed as alternative. These conduits should guide the newly formed axons to the opposite nerve stump while providing a suitable environment for the enhancement of axon regeneration. Among several materials tested for the preparation of these devices, polymers have presented the most promising results. However, a device, which could reproduce results comparable to nerve autograph with suitable degradation ratio in vivo remains to be developed. In an attempt to overcome these limitations, the present work involved the use of the polysaccharide dextran as core material in the preparation of nerve guide conduits. The choice of this polymer relies on its well stablished biocompatibility and biodegradability. In addition, dextran is frequently reported for biomedical applications, being approved by the US Food and Drug Administration (FDA). The initial work undertaken aimed to modify the chemical structure of dextran by the incorporation of double bonds in its chains, for further crosslinking. In this sense, dextrans with different molecular weights were modified with two different monomers, Glycidyl methacrylate (GMA) and 2-Isocyanatoethyl methacrylate (IEMA). Circular transparent membranes were prepared by ultraviolet (UV)-photocrosslinking and the physico-chemical characteristics of the resulting products were evaluated. After the washing and drying stages, the final membranes presented a fragile structure. For this reason, a poly (ε-caprolactone) (PCL) macromonomer modified with IEMA was added to the membrane formulations. As a result, the flexibility of the membranes increased considerably. Additionally, the incorporation of PCL_IEMA did not affect the thermal-mechanical properties. On the other hand, the swelling capacity and in vitro degradation ratio decreased. The work continued with the evaluation of the cytotoxicity of the most promising membranes, using human dental pulp stem cells (hDPSCs). The intracellular concentration of the calcium ion was also measured after the cell viability test. All membranes were considered suitable substrates for cell adhesion and proliferation based on their morphology and healthy calcium ion concentration, suggesting the absence of any apoptosis process. Considering the promising results obtained, the next step focused on the evaluation of the extension of immune response due to implantation of the membranes in rats dorsum. After 15 days of implantation, membranes prepared with dextran modified with GMA and PCL derivative caused an immune response that was classified as “non-irritant”, by the scoring system of the standard ISO 10-998-6. After the relevant results obtained for the prepared materials in a membrane shape, the next step of the work was to achieve the tube conformation. In this regard, molds composed by a quartz tube with an internal 316L stainless steel rod, and with different dimensions were prepared. In order to tailor the final dimensions of the prepared tubes, shrinkage studies were conducted. The formulation, which presented the final dimensions more similar to the commercial product Neurolac®, was then chosen for the further characterization. The structures revealed to be very compact, showing no porosity. For this reason, in order to enhance permeability, D-mannitol was added to the formulations, as porogenic agent, to create voids in the structure of the tubes. The obtained pores presented a mean size in the range between 10-20μm. Posteriorly, the physico-chemical properties of the normal tube and porous tube were evaluated. With the incorporation of D-mannitol, the swelling capacity of the tubes decreased, which may be related to a lower crosslinking density. Moreover, for the porous structure, the in vitro degradation ratio increased, as expected, since the contact surface area also increases. Furthermore, after six months under in vitro hydrolytic tests, both tube structures were able to maintain their structural integrity. The mechanical properties of the tubes were evaluated by performing tensile tests, which revealed that both tubes have the ability to support tension and elongation forces slightly higher than the ones reported for the rat sciatic nerve. It is noteworthy to state that the tubes also were able to resist to preliminary suture tests without visible fragmentation. Finally, nerve guide conduits were tested in the rat sciatic nerve after a neurotmesis injury, for 20 weeks. The functional evaluation results showed that the recovery percentage of motor function is similar for both tubes. In what concerns the sensorial function, the rat group, which received the porous tube revealed higher percentage of recovery. In this sense, porosity seems to induce a positive effect on nerve regeneration. To sum up, this PhD work allowed the validation of dextran as core material for the preparation of nerve guide conduits for peripheral nerve regeneration. The obtained materials present a set of characteristics and properties, which may be relevant for the regeneration process. Furthermore, the fine-tuning of these properties can be easily achieved by changing the formulations used to prepare the tubes.O principal objetivo deste trabalho de doutoramento consistiu no desenvolvimento e avaliação de novos tubos guia preparados a partir polímeros biocompatíveis e biodegradáveis, com aplicação em medicina regenerativa, nomeadamente regeneração de nervos do sistema nervoso periférico. As lesões de nervo periférico são bastante comuns, sendo que as principais causas de incidência desta patologia estão associadas à população jovem masculina, por ocorrência de eventos traumáticos acidentais. A severidade destas lesões varia bastante, no entanto, nos casos mais graves, pode mesmo resultar em incapacidade nervosa permanente. Por este motivo, ao longo do último século têm sido estudadas novas formas de melhorar a regeneração de nervo periférico após uma lesão. A utilização da técnica do autoenxerto revelou ser apresenta resultados mais satisfatórios, provando melhorar a qualidade do nervo regenerado. Contudo, esta técnica implica o recurso a duas cirurgias. Na perspetiva de evitar esta desvantagem, surge o conceito de tubo guia que consiste num tubo oco cuja principal função é fornecer um meio adequado à regeneração do novo nervo guiando o seu crescimento até à extremidade oposta. Nos últimos anos vários materiais têm sido utilizados na preparação destes dispositivos, sendo os materiais poliméricos aqueles que melhores resultados produziram. Porém, ainda não foi desenvolvida uma solução comparável à técnica de autoenxerto com um tempo de degradação in vivo que acompanhe o crescimento do nervo. No sentido de dar resposta a estas limitações, este trabalho envolve a utilização do polissacarídeo dextrano para a preparação de tubos guia. Este polímero foi escolhido como material base devido à sua biocompatibilidade e biodegradabilidade. Com efeito, o dextrano é recorrentemente reportado para aplicações biomédicas, sendo aprovado pela “US Food and Drug Administration” (FDA). Numa fase inicial do trabalho pretendeu-se modificar a estrutura química do dextrano, através da incorporação de ligações duplas nas suas cadeias, para posterior reticulação. Assim, dextrano de pesos moleculares diferentes foi modificado com dois monómeros diferentes, metacrilato de glicidilo (GMA) e metacrilato de 2-isocianoetilo (IEMA). Seguidamente, membranas circulares transparentes foram preparadas através da reticulação das cadeias dos materiais preparados, por radiação ultravioleta (UV). As suas características físico-químicas foram posteriormente avaliadas. Devido à fragilidade demonstrada por estas membranas, foi adicionado às formulações iniciais um macro monómero de base poli (ε-caprolactona) (PCL) modificado com IEMA. Como resultado, as membranas preparadas com dextrano modificado juntamente com o co monómero revelaram maior flexibilidade comparativamente às membranas previamente preparadas. Com a incorporação deste macro monómero verificou-se uma diminuição na capacidade de inchaço e da velocidade de degradação in vitro, não prejudicando, contudo, as propriedades térmo-mecânicas das membranas. O trabalho prosseguiu com a avaliação da citotoxicidade das membranas que apresentaram propriedades mais apropriadas para a aplicação em questão, com recurso a células da polpa dentária humana (hDPSC). A concentração do ião cálcio intracelular foi medida para atestar a viabilidade celular das células aderidas às membranas. Todas as membranas mostraram ser substratos apropriados para a adesão e proliferação celular, sugerindo a ausência de início do processo apoptótico. Seguidamente foi avaliada a extensão da reação imunológica provocada pela implantação subcutânea destas membranas no dorso de ratos. Neste caso, as membranas preparadas com dextrano modificado com GMA, e com a adição de PCL modificado com IEMA provocaram uma resposta imunológica, ao fim de 15 dias, que foi classificada de “não irritante”, através do sistema de pontuação proposto pela norma ISO 10-998-6. Face aos resultados relevantes, a etapa seguinte do trabalho consistiu na preparação de um tubo, utilizando as melhoras formulações de membranas. Neste sentido, foi preparado um molde de quartzo com uma vara de aço inoxidável 316L por forma a criar tubos ocos. Os moldes foram preparados com vista à obtenção de dimensões finais semelhantes às do produto comercial Neurolac®. Foram conduzidos estudos para avaliar o encolhimento das estruturas tubulares, permitindo assim a escolha da formulação mais adequada. Através de microscopia electrónica de varrimento (SEM) foi possível avaliação a superfície dos tubos, que se revelou ser bastante compacta. Neste sentido, foi adicionado D-Mannitol como agente porogénico, de modo que aumentar a permeabilidade dos tubos, por meio de indução de porosidade. Com recurso a esta técnica foi possível obter porosidade com tamanho médio compreendido entre 10-20µm. Posteriormente foi feito um estudo comparativo das propriedades físico-químicas do tubo sem porosidade e com porosidade. Com a introdução do D-mannitol, a capacidade de inchamento dos tubos diminuiu, o que pode denotar uma estrutura com menor densidade de reticulação. No entanto, com a porosidade, a velocidade de degradação dos tubos aumentou, como seria de esperar, visto que a superfície de contacto com o meio também é superior. Contudo, ao fim de seis meses, em solução de PBS os dois tubos mantiveram a sua integridade estrutural. As propriedades mecânicas destes tubos foram também avaliadas através de ensaios de tração uniaxial. Estes testes revelaram que os tubos têm capacidade de resistir a forças de tensão e elongação ligeiramente superiores às do nervo ciático de rato. De notar que estes tubos revelaram ser resistentes a testes preliminares de perfuração com sutura, sem fragmentação visível. Finalmente, os tubos guia foram testados em nervos ciáticos de ratos, após uma lesão de neurotmese induzida. Ao longo de 20 semanas os resultados da avaliação funcional do nervo lesionado mostram que em termos de função motora, a recuperação é semelhante para o tubo não poroso e para o tubo poroso. No que concerne a função sensorial, o grupo de ratos que recebeu o tubo poroso mostrou maior índice de recuperação. Assim, a porosidade aparenta ter um efeito positivo na regeneração do nervo. Este trabalho permitiu validar o dextrano como material base para a preparação de tubos-guia para a regeneração de nervo periférico. Os materiais obtidos apresentam um conjunto de características e propriedades relevantes para o processo regenerativo. Com efeito, estas podem ainda ser facilmente adaptadas através da alteração das formulações utilizadas para preparar os tubos.Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) - bolsa de doutoramento PD/BD/52626/201