Imobilização covalente de tripsina em membranas de nanofibras poliméricas obtidas por electrofiação

Dissertação de Mestrado Integrado em Engenharia Química apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraAnualmente, são produzidas em Portugal entre 500 000 a 560 000 toneladas de soro de leite como subproduto da indústria dos lacticínios. Este resíduo é muito rico em proteínas e a sua valorização torna-se vantajosa a nível económico e ambiental. Da hidrólise destas proteínas originam-se peptídeos bioactivos com características muito proveitosas quando aplicados em cosméticos ou fármacos. Neste trabalho, pretendeu-se contribuir para a criação de um sistema integrado de biocatálise e separação para hidrolisar as proteínas de soro de leite e, ao mesmo tempo, manter a enzima separada dos produtos de reacção. Para o efeito, imobilizou-se a enzima tripsina em membranas de nanofibras constituídas por poli(tereftalato de etileno) e poli(ácido láctico) (PET/PLA), tendo sido testadas três metodologias de imobilização covalente: i) imobilização por ligação covalente (activação do suporte com uma carbodiimida), ii) imobilização por adsorção e reticulação (via glutaraldeído) e iii) imobilização por ligação covalente de agregados de tripsina reticulada com glutaraldeído a membranas modificadas com um braço extensor de hexametilenodiamina. Os melhores resultados de actividade enzimática imobilizada foram alcançados com o último método, tendo sido este o escolhido para os estudos subsequentes. A actividade da tripsina imobilizada foi estudada a diferentes valores de temperatura, pH e velocidade de fluxo. Foi ainda avaliada a estabilidade ao armazenamento em água destilada para três temperaturas (temperatura ambiente, 4 °C e –20 °C), assim como a estabilidade operacional. Ao fim de um mês de armazenamento a 4 °C e em água destilada, o sistema biocatalítico não apresentou perda de actividade enzimática nem perda de enzima. Verificou-se também que, ao fim de 11 utilizações sucessivas, restava 80% da actividade enzimática inicial, não ocorrendo libertação da enzima. Os resultados obtidos indicam que o método de imobilização seleccionado permite a preparação de um sistema estável e reutilizável. O suporte de imobilização utilizado, membranas de nanofibras de PET/PLA obtidas por electrofiação, foi caracterizado a nível de molhabilidade da superfície, absorção de água, composição química, morfologia da superfície e estabilidade térmica, por comparação com uma membrana de PET obtida pela mesma técnica. A caracterização mostrou que a utilização de PLA nas membranas aumentou a capacidade de absorção de água. O estudo por espectroscopia de infravermelho e calorimetria indicou não existir interacção significativa entre as moléculas de PET e PLA. As membranas preparadas continham nanofibras com algumas centenas de nanómetros de diâmetro, predominantemente alinhadas segundo uma direcção.Every year, in Portugal, are produced from 500 000 to 560 000 tons of whey as a by-product of the dairy industry. This residue is very rich in proteins and their valorization becomes advantageous at an economic and environmental level. Hydrolysis of these proteins originate bioactive peptides with very useful characteristics when applied in cosmetics or pharmaceuticals. In this work, it was intended to contribute for the development of an integrated separation and catalysis system to hydrolyze whey proteins and, at the same time, maintaining the reaction products separated from the enzyme. For this purpose, trypsin, an enzyme, was immobilized onto nanofibrous membranes consisting of poly(ethylene terephthalate) and poly(lactic acid) (PET/PLA) by three covalent immobilization methods: i) immobilization by covalent binding (activation of the support with a carbodiimide), ii) immobilized by adsorption and crosslinking (via glutaraldehyde) and iii) covalent immobilization of trypsin aggregates, crosslinked with glutaraldehyde, onto membranes modified with a spacer arm of hexamethylenediamine. The chosen method was the last, as it was with this that the best results of immobilized enzyme activity were achieved. The activity of immobilized trypsin was studied at different temperatures, pH and flow rate. It was also assessed the storage stability in distilled water for three temperatures (room temperature, 4 °C and −20 °C) and also the operational stability. After one month, at 4 °C, in distilled water, the biocatalytic system presents no loss of enzymatic activity or enzyme. It was also found that after 11 consecutive uses, there was yet 80% of the initial enzymatic activity and without enzyme release. The results indicate that the selected immobilization method allows the preparation of a stable and reusable biocatalytic system. The immobilization support used, nanofibrous PET/PLA membranes, obtained by electrospinning, was characterized in terms of surface wettability, water absorption, chemical composition, surface morphology and thermal stability, in comparison with a PET membrane obtained by the same technique. The characterization showed that the use of PLA in the membrane increased the water absorption capacity. The study by infrared spectroscopy and calorimetry showed no significant interaction between the molecules of PET and PLA. The prepared membranes contained nanofibers with a few hundred nanometers in diameter, predominantly aligned in one direction