Análise do efeito de vários tipos de compostos na micropropagação de medronheiro (Arbutus unedo L.)

Dissertação de Mestrado em Biodiversidade e Biotecnologia Vegetal, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.Arbutus unedo é uma espécie de porte arbustivo ou arbóreo e pode ser encontrado um pouco por toda a Bacia Mediterrânica, norte de África e costa Atlântica da Península Ibérica e da Irlanda. Em Portugal, ocorre com maior predominância nas regiões montanhosas do sul (Serra do Monchique, Arrábida e Caldeirão). No norte e centro do país (Oleiros, Pampilhosa, Sertã) as populações de medronheiro encontram-se fortemente fragmentadas devido a intensos programas de reflorestação com eucalipto. A sua forte capacidade de regeneração após ocorrência de incêndios florestais torna-o numa importante ferramenta para a reflorestação de zonas afectadas pelo fogo. Ainda que possua o estatuto de “Neglected and Underutilized Specie” (www.underutilized-species.org), o medronheiro é uma das espécies com maior importância económica do género Arbutus. Tal impacto deve-se quase exclusivamente à comercialização da aguardente produzida a partir da fermentação e posterior destilação do medronho. Ainda que sejam bem conhecidos os benefícios que podem resultar do consumo do fruto fresco, a aposta na sua comercialização tem sido negligenciada. As principais razões que podem explicar esta realidade prendem-se com a inexistência de uma rede de distribuição eficaz, uma reduzida capacidade de produção que não se coaduna com os requisitos das grandes superfícies e ao facto de este continuar a ser um fruto relativamente desconhecido pelo público em geral. No presente trabalho testou-se, pela primeira vez, o efeito das proteínas arabinogalactanas (AGP) na proliferação de meristemas e ainda da ureia e tioureia e das citocininas 2iP ((6-(γ,γ-Dimethylallylamino)purine)) e zeatina. No caso das AGPs verificou-se que as concentrações de 4 mg/L e 8 mg/L, em ambos os clones testados, estimularam significativamente o desenvolvimento e multiplicação dos novos rebentos. De forma a testar o efeito que a assimilação da AGP poderá exercer na formação da estrutura radicular recorreu-se aos sistemas de enraizamento in vitro e ex vitro dos rebentos obtidos. A análise da estrutura radicular dos rebentos previamente expostos ao AGP permitiu concluir que não existem diferenças significativas. A tioureia mostrou ser uma fonte de azoto mais eficaz que a ureia, notando-se um maior efeito no crescimento para concentrações de 10 mg/L, ainda que sem diferenças significativas. Também foi testado o efeito das citocininas zeatina e 2iP, tendo-se verificado que a primeira é capaz de induzir um maior crescimento e multiplicação dos rebentos. Foram as concentrações de 1 mg/L, 2 mg/L e 4 mg/L, em ambas as hormonas, que levaram ao aumento significativo no número de rebentos e peso do material obtido no fim da cultura. Nos ensaios de embriogénese somática avaliou-se o efeito de diferentes fontes de carbono no meio de indução. O incremento dos níveis de sacarose (6% e 9%) foi acompanhado pelo aumento do número de embriões formados. A exposição a 9% induziu a formação de um número significativamente superior de embriões somáticos ao verificado no controlo (3% sacarose) A descoberta de compostos que possam estimular a resposta dos explantes é essencial para aumentar a eficácia dos diferentes processos de propagação in vitro. Os resultados aqui apresentados poderão contribuir para a optimização dos protocolos de micropropagação do medronheiro. No entanto, para que os compostos analisados possam contribuir eficazmente na propagação em larga escala, deverão ser realizados estudos mais detalhados de forma a perceber melhor o modo como actuam nestes processos de morfogénese in vitroArbutus unedo is a tree or shrub-like species that can be found throughout the Mediterranean basin, North Africa, the Atlantic coast of the Iberian Peninsula, and Ireland. In Portugal it occurs mainly in the southern mountain regions of Monchique, Arrábida and Caldeirão Mountains. In the north and center (Oleiros, Pampilhosa, Sertã) regions strawberry tree populations are strongly fragmented due to intense reforestation programs with eucalypt. Its strong ability to resprout after the occurrence of forest fires makes it an important species for reforestation progrmas in areas strongly affected by forest fires. Although A. unedo possess the “Neglected or Underutilized Specie” status (www.underutilized-species.org), it constitutes one of the most economically important species on the Arbutus genus. Such economic impact is almost exclusively due to the commercialization of the traditional fruit brandy, known as “Aguardente de Medronho”, produced by the fermentation and subsequent distillation of the fruits. Although the benefits associated to the consumption of the fruits are well known and studied, commercialization as a fresh fruit has been neglected by most producers. Such reality may be related to the lack of an effective distribution system, a lower production volume than required by the large supermarkets and also because the fruit is still quit unknown among urban populations. In the work here presented, it was tested, for the first time, the effect of AGP on meristem proliferation, as well as that of urea and thiourea and the cytokines 2iP ((6-(γ,γ- Dimethylallylamino)purine)) and zeatin. In both clones tested, the treatment with 4 mg/L or 8 mg/L of AGP significantly stimulate the development and multiplication of new shoots. In order to test the effect that the AGP may have on root formation, shoots produced in vitro were submitted to two rooting protocols: ex vitro and in vitro. No significant differences were found among the root structure formed by the shoots preexposed to different AGP concentrations, what may indicate that such compound doesn’t affect the root formation. Thiourea proved to be a more efficient nitrogen source when compared with urea, and its major impact on the shoot growth and proliferation was detected at concentrations of 10 mg/L. The effect of the cytokinins zeatin and 2iP was also addressed and it was found that the first one was more efficient promoting shoot growth and proliferation. Statistically significant differences on the effect of both cytokinins were detected at 1 mg/L, 2 mg/L and 4 mg/L through the formation of a higher number of shoots per explante, as well as more developed shoots. In the somatic embryogenesis assay the effect of different carbon sources added to the induction medium was assessed. Higher sucrose levels (6% and 9% sucrose) stimulate the production of a higher number of somatic embryos. The exposure to 9% sucrose induced the formation of a significantly higher number of embryos, when compared with the control group (3% sucrose) The effectiveness of new compounds that stimulate the in vitro physiological responses is essential to increase the efficiency of in vitro propagation. The results here described may contribute to the optimization of A. unedo micropropagation protocols. However, further studies are required to understand how these metabolites affect the morphogenic processes occurring in vitr