Ensaios de biotransformação e cultura in vitro aplicados à valorização do medronheiro ( Arbutus unedo L.)

SOUSA, Lucie Domingues De - Ensaios de biotransformação e cultura in vitro aplicados à valorização do medronheiro ( Arbutus unedo L.). Coimbra : [s.n.], 2015. Dissertação de Mestrado em Biodiversidade e Biotecnologia Vegetal.Arbutus unedo L, conhecido comummente por medronheiro é um arbusto ou árvore de pequeno porte, da família Ericaceae, típica do clima mediterrânico. É uma planta bastante resistente a condições ambientais difíceis, que aparece muitas vezes associada a outras espécies como pinheiro bravo e sobreiro, formando uma comunidade arbustiva. O medronheiro é uma espécie conhecida desde tempos antigos pelas suas diversas utilidades, não só a nível farmacêutico, pelas propriedades das suas folhas e frutos, mas também a nível ecológico, ornamental, entre outros. Os seus frutos são muitas vezes utilizados na confeção de produtos tradicionais como doces, geleias e a notável aguardente de medronho. Nos últimos anos esta espécie tem vindo a ganhar interesse científico principalmente em termos de micropropagação mas também a nível do estudo da sua composição fitoquímica. O presente trabalho surge com o propósito de se explorarem novas áreas de interesse no medronheiro. Pretendeu-se portanto desenvolver um protocolo de indução de calo e otimizar as suas condições de cultura; avaliar a presença de arbutina e hidroquinona em plantas de medronheiro (folhas e frutos) e a capacidade de culturas in vitro produzirem arbutina durante o seu metabolismo normal, ou quando sujeitas a um tratamento com hidroquinona; testar um novo método de enraizamento – dipping, baseado na indução da formação de raízes por choque auxínico. No ensaio de indução de calo verificou-se que, de várias combinações hormonais testadas, a combinação de 1 mg/L de 2,4-D e 1 mg/L de tidiazurão apresentou o maior crescimento dos calos. A adição de tidiazurão permitiu estimular o crescimento do calo, o que não foi verificado nos outros meios de cultura. Os calos obtidos foram posteriormente utilizados para a avaliação da sua cinética de crescimento em dois ensaios paralelos, realizados em meio de cultura agarizado e líquido. O ensaio desenvolvido em meio agarizado demonstrou a influência de diferentes tipos de recipientes no incremento em massa dos calos e revelou a essencialidade das trocas gasosas na promoção do crescimento das culturas. A experiência realizada em meio líquido permitiu inferir sobre a razão massa de calo inicial/ volume de meio de cultura mais favorável ao incremento das culturas. Neste estudo constatou-se que massas iniciais mais elevadas foram as responsáveis pelos maiores incrementos dos calos nos dois volumes testados. Os estudos histológicos realizados em calos com diferentes características permitiram verificar a ocorrência de algumas diferenças histológicas, particularmente entre calos com diferentes taxas de crescimento. Os ensaios fitoquímicos, realizados neste trabalho demonstraram que as folhas colhidas no campo apresentaram teores fenólicos cerca de 10 vezes superiores aos encontrados nos frutos. No entanto, o estado de desenvolvimento das folhas e de maturação dos frutos não demonstraram ter uma influência significativa no teor de fenóis totais. A análise por cromatografia líquida de alta resolução hifenada a um detetor de fotodíodos (HPLC-PDA) confirmou a presença de arbutina nas plantas de medronheiro crescidas no seu ambiente natural, e também em plantas cultivadas in vitro, com ou sem a adição de hidroquinona. Nos ensaios de biotransformação, a concentração de hidroquinona adicionada ao meio de cultura foi responsável pelas maiores diferenças na concentração de arbutina encontrada nas plantas, porém o tempo de exposição também interferiu significativamente. O enraizamento foi testado ex vitro por choque auxínico com uma solução de IBA (9,8 mM) em plantas formadas em meio líquido e sólido. A formação de raízes foi observada 20 dias após o tratamento, mostrando a eficiência deste processo no enraizamento do medronheiroArbutus unedo L., commonly known as strawberry tree is a shrub or a small tree from the Ericaceae family, common around the Mediterranean basin. This plant is quite resistant to harsh environmental conditions, and appears to be usually associated with other plant species such as maritime pine and cork oak. Strawberry tree is a well known species since ancient times due to its vast utilities, not only at from a pharmaceutical perspective, but also as an interesting ecological and ornamental plant, among others. Its fruits are generally used in the confection of traditional products such as jams and the distinguishable “Portuguese brandy” usually called as medronheira. In the last years this species has gained the attention of the scientific community mainly because of its micropropagation abilities but also due to diversity of chemical compounds that have been identified. The present work emerges from the purpose to explore new areas of interest concerning the strawberry tree. It was intended to develop a protocol of calli induction and optimize its culture conditions; assess the presence of arbutin and hydroquinone in the strawberry tree (leaves and fruits) as well as the ability of in vitro culture to produce arbutin during its normal metabolism, or when subjected to a hydroquinone treatment; testing an innovative method of rooting- dipping - based on the induction of root development by an auxinic pulse. In the callus induction assays, the results showed that from the several hormones tested, the combination of 1 mg/L of 2,4-D and 1 mg/L de thidiazuron exhibited the better results .Moreover, thidiazuron allowed the stimulation of callus growth a situation that was not verified on other culture media. The calli obtain were further submitted to a growth kinetic assay in gellified or liquid media. Cultures on agar medium demonstrated that the type of containers affects callus growth probably by affecting the composition of the atmosphere surrounding the tissues. The assay carried out on liquid cultures allowed to establish an appropriate ratio of initial callus mass/ volume of the culture medium most favorable for growth. The results showed that higher initial callus masses were responsible for higher calli increments on both volumes tested. The histological studies performed on calli with distinct characteristics showed the existence of some histological differences, in particular among calli with different growth rates. The phytochemical trials performed in this work indicated that leaves harvested in the field exhibited phenolic contents about 10 times higher than fruits. Nevertheless, both the state of leaf and fruit development did not show to have a significant influence in the total phenolic content. The analyses by high performance liquid chromatography with photodiode array (HPLC-PDA) confirmed the presence of arbutin for strawberry tree grown on its natural environment, and also for plants cultivated in vitro, with or without the addition of hydroquinone. In the biotransformation assays, the concentration of hydroquinone added to the cultured medium was responsible for the major differences in the concentration of arbutin found in plants; however the exposure time also interfered significantly. Rooting was tested ex vitro by auxinic pulse with a IBA (9,8 mM) on plants formed on liquid and solid medium. The formation of roots was observed 20 days after treatment, showing the efficiency of this process in the strawberry tree rooting