Avaliação dos mecanismos moleculares de resistência a hipometilantes em Leucemia Mieloide Aguda

CORREDEIRA, Patrícia Isabel Martins - Avaliação dos mecanismos moleculares de resistência a hipometilantes em Leucemia Mieloide Aguda. Coimbra : [s.n.], 2016. Dissertação de Mestrado.A leucemia mieloide aguda (LMA) é uma neoplasia complexa e heterogénea da célula progenitora hematopoiética, cujas características incluem desregulação da diferenciação, proliferação clonal e acumulação na medula óssea de células mieloides imaturas. A leucemia promielocítica aguda é um subtipo raro de LMA em que existe acumulação de promielócitos na medula óssea. A maioria dos casos está associado a uma translocação reciproca t(15;17) (q24.1;q21.2) envolvendo os genes PML/RARα. Apesar dos bons resultados da terapêutica com o ácido all-trans retinóico (ATRA), um indutor da diferenciação, alguns doentes desenvolvem efeitos secundários (ex. síndrome do ATRA) e/ou resistência à terapêutica. Neste sentido, tornou-se necessário o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Sabendo que as células tumorais estão geralmente, hipermetiladas na zona do promotor de genes supressores tumorais, o que conduz ao seu silenciamento epigenético, foi relevante a partir desta característica desenvolver novas terapias dirigidas a alvos moleculares. Assim surgiu a terapia epigenética através de moduladores epigenéticos, nomeadamente os agentes hipometilantes e os inibidores das desacetilases das histonas. Os hipometilantes como a 5-azacitidina (AZA) e a 2’-deoxy-5-decitabina (DAC) estão atualmente aprovados para o tratamento de algumas neoplasias hematológicas, incluindo leucemias mieloides agudas e síndromes mielodisplásicas. A eficácia da terapia epigenética depende da capacidade de transporte do fármaco para o tecido alvo, entre outros mecanismos. Alterações na atividade e/ou expressão dos transportadores de influxo e efluxo, e ainda em enzimas de metabolismo como a UDP (uridina difosfato) glucuronosil transferase família 1 membro A1 (UGT1A1), podem influenciar a eficiência farmacológica dos fármacos hipometilantes. O objetivo deste trabalho consistiu em avaliar alguns mecanismos moleculares envolvidos na resistência a moduladores epigenéticos (hipometilantes), em particular o envolvimento dos transportadores de efluxo da família ABC e das proteínas vault, na leucemia mieloide aguda. Para a realização do trabalho experimental foi utilizada uma linha celular de LMA/LPA (sem a translocação PML/RARα), a linha celular HL-60, e uma sublinharesistente ao fármaco azacitidina, as células HL-60AZA, (previamente estabelecida no Laboratório de Oncobiologia e Hematologia (LOH) da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra). Ambas as linhas celulares foram incubadas com doses crescentes de azacitidina e decitabina durante 72h. A proliferação e viabilidade celulares foram avaliadas através do teste de exclusão azul de tripano e o tipo de morte celular por microscopia ótica (morfologia celular) após coloração das células com May-Grünwald-Giemsa. Os níveis de expressão génica do transportador membranar ABCG2 (gene que codifica a proteína BCRP), assim como do gene da enzima UGT1A1, foram determinados por PCR em tempo real. Os níveis de expressão proteica dos transportadores membranares da família ABC, glicoproteína-P (P-gp), MRP1 e da proteína transportadora nuclear major vault (MVP ou LRP), foram avaliados recorrendo à técnica de citometria de fluxo. Por fim, através da técnica de MS-MLPA (Methylation-Specific Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), analisou-se o perfil de metilação de vários genes supressores tumorais (TP73, MSH6, VHL, RARβ, ESR1, CDKN2A, PAX5, KLLN, MGMGT, PAX6, WT1, CD44, GSTP1, ATM, CADM1, CHF3, BRCA2, RB1, THBS1, PYCARD, CDH13, TP53, BCRA1, STK11, GATA5) nas duas linhas celulares em estudo. Em termos de resultados observou-se um efeito citostático (dependente da concentração do fármaco e da linha celular) e citotóxico (dependente da concentração, do tempo de incubação e da linha celular) induzidos pela azacitidina. Estes efeitos foram mais evidentes na linha HL-60 do que na linha resistente, HL-60AZA. O IC50 da linha HL-60AZA foi de 187,1 μM e o da linha HL-60 de 58,5 μM, o que demonstra que as células HL-60AZA são cerca de 3,2 vezes mais resistentes à azacitidina relativamente às células parentais sensíveis. De igual modo, a decitabina induziu um efeito citostático e citotóxico dependentes da concentração de fármaco, do tempo de incubação e da linha celular, superiores na linha celular sensível, comparativamente à linha resistente. No entanto, a concentração de decitabina necessária para atingir o IC50 foi inferior à da azacitidina. A sublinha celular HL-60AZA (cujo IC50 foi de 5195 μM) revelou ser resistente 110,8 vezes superior, comparativamente à linha celular sensível (cujo IC50 foi de 46,9 μM). No presente trabalho observou-se resistência cruzada à decitabina nas células resistentes à azacitidina, indicando, que em caso de resistência a um análogo de nucleósido, haverá resistência a fármacos da mesma família. 5 Morfologicamente, as células HL-60 incubadas durante 72h com 5 μM de azacitidina apresentam menor razão núcleo-citoplasma, comparativamente à situação controlo e às células HL-60AZA incubadas nas mesmas condições. A avaliação dos perfis de metilação e do número de cópias dos genes estudados, não revelou diferenças entre a linha celular HL-60AZA e a linha parental HL-60. No entanto, nas células resistentes observou-se um aumento estatisticamente significativo dos níveis de expressão proteica dos transportadores da família ABC, glicoproteína-P e MRP1, e de MVP e uma tendência para aumento dos níveis de expressão dos genes ABCG2 e UGT1A1. Em conclusão, os resultados sugerem o envolvimento dos transportadores glicoproteína-P, MRP1 e MVP no desenvolvimento de resistência à azacitidina na leucemia mieloide aguda.The acute myeloid leukaemia (AML) is a complex and heterogeneous neoplasia of the hematopoietic parental cell that is characterized by disruption of differentiation, clonal proliferation and bone marrow accumulation of immature myeloid cells. The acute promyelocytic leukaemia is a rare subtype of AML characterised by accumulation of promyelocites in the bone marrow. Most cases are associated with a reciprocal translocation t(15;17) (q21.4;q21.2) involving the PML/RARα genes. Despite the good results of the treatment using all-trans retinoic acid (ATRA), a differentiation inductor, some patients develop side effects (i.e. ATRA syndrome) and/or resistance to therapy. So, novel treatment strategies are deemed as necessary. The knowledge that cancer cells are, generally, hypermethylated in the tumoural suppressor genes’ promotor zone, which causes its epigenetic silencing, was used to develop new therapies with molecular targets. Therefore, the epigenetic therapy through epigenetic modulators has emerged, namely using hypomethylation agents and histone deacetylase inhibitors. Hypomethylants like 5-azacitidine (AZA) and 2’-deoxy-5-decitabine (DAC) are currently approved for treatment of haematological neoplasia, including acute myeloid leukaemia and myelodysplastic syndrome. Epigenetic therapy efficiency depends on the efficacy of transport of the pharmaceuticals into the intended tissue, among other factors. Changes in the activity and/or expression of influx/outflux transporters, and also metabolism enzymes like UPD (uridine diphosphate) glucuronosyltransferase family 1 member A1 (UGT1A1), can influence the pharmaceutical efficiency of hypomethylant pharmaceuticals. The objective of the present work was to evaluate the mechanisms responsible for molecular resistance to epigenetic modulators (hypomethylants), in particular the evolvement of outflux transporters of the ABC family and the vault proteins, in acute myeloid leukaemia (AML). In this study there were used cell lines of AML/APL (without the PML/RARα), HL-60 cell line and azacitidine-resistant cell line (HL-60AZA; previously developed at the Hematology and Oncobiology Laboratory (HOL), Faculty of Medicine, University of Coimbra. Both cell lines were incubated with increasing dosages of azacitidine and decitabine in a period of 72h. The proliferation 8 and cell viability were evaluated using the trypan blue exclusion assay and the type of celular death was evaluated through optical microscopy (cell morphology) after coloration via May-Grünwald-Giemsa dyeing. Expression levels of membrane transporters ABCG2 (gene that transcodes the BCRP protein), and of the metabolism enzyme UGT1A1 were determined through real time PCR. The protein expression levels of the membrane transporters of the ABC family, P-glycoprotein (P-gp), MRP1 and the major vault nuclear transporter (MVP, also known as LPR) were determined using flow cytometry. Finally, the MS-PLPA (Methylation-Specific Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) technique was used to evaluate the methylation profile of the various tumour suppressor genes (TP73, MSH6, VHL, RARβ, ESR1, CDKN2A, PAX5, KLLN, MGMGT, PAX6, WT1, CD44, GSTP1, ATM, CADM1, CHF3, BRCA2, RB1, THBS1, PYCARD, CDH13, TP53, BCRA1, STK11, GATA5) in the two studied cellular lines. The results show that there was a cytostatic (depending on the drug concentration and the cell line) and cytotoxic (depending on the concentration, the incubation time and the cell line) effect induced by the azacitidine. These conclusions were more evident on the HL-60 cell line rather than the resistant line, HL-60AZA. The IC50 at the HL-60AZA cell line was of 187,1 μM and at the HL-60 line was of 58,5 μM, which demonstrates that the HL-60AZA cells are about 3.2 times more resistant to azacitidine relative to the sensitive parental cell line. There were also observed cytostatic and cytotoxic effects varying on the drug concentration, the incubation time and the cell line, in the decitabine incubations, that were higher in the sensitive line relative to the resistant cell line. However, the decitabine concentration necessary to reach IC50 is inferior to that of the azacitidine. The HL-60AZA (which IC50 was 5195 μM) revealed to be 110.8 times more resistant, when compared to the sensitive cell line (that had an IC50 of 46.9 μM). The present work it can be observed that there was developed cross resistance to the decitabine in the azacitidine resistant cells, which indicates that in case of resistance to an analogous nucleoside, there will be resistance to drugs of the same family. Morphologically, the HL-60 cell line incubated in 72h with 5 μM of azacitidine show an inferior nucleus-cytoplasm structural ratio, when compared with the control line and to the HL-60AZA cell line in the same incubation conditions. As of the methylation profiles and number of copies of the studied genes, there was no 9 difference between the HL-60AZA cell subline and the parental HL-60 line. However, in the resistant cells a statistically relevant increase of the proteic expression levels of the ABC family, P-glycoprotein, MRP1 and MVP transporters was observed, as well as a tendency of increasing the expression levels of the ABCG2 and UGT1A1 genes. In conclusion, the results suggest the evolvement of P-glycoprotein, MRP1 and MVP transporters in the developing of resistance to azacitidine in acute myeloid leukaemia