Cisplatin-like Compounds as Potential Chemotherapeutics: from the Bench to the Cell

Tese de doutoramento em Biociências, na especialidade de Bioquímica, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraDespite all efforts, cancer is still a growing health problem worldwide, metastatic breast carcinoma being the second most lethal cancer among women. So, improvement of chemotherapeutic approaches to metastatic breast carcinoma is a goal of the utmost importance in the public health area. Since Rosenberg´s serendipitous discovery of cisplatin, a widely used antineoplastic agent, other metal-based antitumour compounds have been pursued with a view to overcome cisplatin´s severe nephrotoxicity and acquired resistance. One of the research lines along this subject concerns polynuclear chelates comprising cisplatin-like moieties linked by biogenic polyamine chains. The present study focuses on two dinuclear Pt(II) and Pd(II) chelates with spermine (Pt2Spm and Pd2Spm), probing their cellular impact (alone or in combination). The first aim of this work was to evaluate the antineoplastic properties of these complexes towards triple negative human breast carcinoma cells (MDA-MB-231), in sole administration and combined with the anti-mitotic agent Docetaxel (Taxotere®), regarding anti-proliferative, anti-invasive and anti-angiogenic capacities, in search for a synergistic interaction. Improved therapeutic schemes were sought, capable of increasing the survival rates for this poor prognosis cancer, hopefully circumventing chemoresistance to cisplatin-like agents. Promising anti-proliferative, anti-invasive and anti-angiogenic abilities were found for Pd2Spm/Docetaxel combinations. In addition, studies of drug–cell interactions in cancer model systems were pursued, since they are essential in the pre-clinical stage of rational drug design, which relies on a thorough understanding of the mechanisms underlying cytotoxic activity and biological effects, at a molecular level. With the use of complementary vibrational spectroscopy methods, the cellular impact of Pt2Spm and Pd2Spm was assessed, using cisplatin as a reference compound. The effects on cellular metabolism were monitored in MDA-MB-231 cells, by Raman and synchrotron-radiation infrared microspectroscopies, for different drug concentrations (2 – 8 µM) at a 48 h drug exposure. Multivariate data analysis was applied, unveiling drug- and concentration-dependent effects: apart from discrimination between control and drug-treated cells, a clear separation was obtained for the different agents studied – Pt(II) vs Pd(II), and mononuclear (cisplatin) vs polynuclear (Pt2Spm and Pd2Spm). Spectral biomarkers of drug action were identified, as well as the cellular response to the chemotherapeutic insult. The main effect of the tested compounds was found to be on DNA, lipids and proteins, the Pd(II) agent having a more significant impact on proteins while its Pt(II) homologue affected the cellular lipid content at lower concentrations. These results suggest the occurrence of distinct and unconventional pathways of cytotoxicity for these dinuclear polyamine complexes. Raman and FTIR microspectroscopies were confirmed as powerful non-invasive techniques to obtain unique spectral signatures of the biochemical impact and physiological reaction of cells to anticancer agents. Finally, the first neutron scattering study on human cells is reported, for addressing the subject of solvent slaving to a drug by probing intracellular water, with a view to ascertain variations upon drug exposure. Inelastic and quasi-elastic neutron scattering spectroscopy experiments with isotope labelling were performed, for monitoring this interfacial water response to cisplatin treatment (at 8 and 20 µM) in the same cell line (MDA-MB-231). Optical vibrational data were also obtained, for lyophilised cells. The intracellular water behaviour in the presence of cisplatin was found to be different from bulk water as well as from cytoplasmic water in drug-free cells. Concentration-dependent dynamical changes evidencing a progressive mobility reduction were unveiled between untreated and cisplatin-exposed samples, concurrent with variations in the native organisation of water molecules within the intracellular medium as a consequence of drug action. The results thus obtained yielded a clear picture of the intracellular water response to cisplatin and constitute the first reported experimental proof of a drug impact on the cytomatrix by neutron techniques. This is an innovative way of tackling a drug´s pharmacodynamics, searching for alternative targets of drug action (secondary drug targets).Apesar de todos os esforços, o cancro continua a ser um problema de saúde mundial sendo o cancro de mama metastático o segundo mais letal em mulheres. Assim, melhorar as abordagens quimioterapêuticas no caso do cancro de mama metastático é de extrema importância para a saúde pública. Desde a descoberta da cisplatina por Rosenberg que esta passou a ser amplamente utilizada em oncologia. No entanto, devido à sua elevada nefrotoxicidade e resistência adquirida a procura de outros compostos inorgânicos com vista a ultrapassar estes problemas é de extrema importância. Uma das linhas de investigação na área é a inclusão de unidades semelhantes à cisplatina em quelatos polinucleares utilizando poliaminas biogénicas como ligandos. Este trabalho visa explorar o impacto celular de dois quelatos dinucleares de Pt(II) e de Pd(II) com espermina (Pt2Spm e Pd2Spm), tanto em administração isolada como em combinação com outros fármacos. O primeiro objetivo deste estudo foi avaliar as propriedades antineoplásicas destes complexos quando administrados isoladamente ou em combinação com o Docetaxel (Taxotere®), um agente anti-mitótico, numa linha celular humana de cancro de mama triplo negativo (MDA-MB231), avaliando a sua capacidade anti-proliferativa, anti-invasiva e anti-angiogénica, com vista à obtenção de sinergismo. O desenvolvimento de melhores esquemas terapêuticos poderá levar a um aumento da percentagem de sobrevivência para este tipo de cancro (de fraco prognóstico), contornando a resistência à quimioterapia para complexos semelhantes à cisplatina. Para a combinação Pd2Spm/Docetaxel foram obtidos efeitos anti-proliferativo, anti-invasivo e anti-angiogénico muito promissores. Foram ainda realizados estudos de interação fármaco-célula em modelos de cancro humano, sendo estes essenciais ao desenvolvimento racional de fármacos numa fase pré-clínica. A utilização de métodos complementares de espectroscopia vibracional permitiu determinar o impacto celular dos complexos Pt2Spm e Pd2Spm, usando a cisplatina como composto referência. O impacto sobre o metabolismo celular foi monitorizado para a linha MDA-MB231, por microespectroscopias de Raman e Infravermelho (com radiação de sincrotrão) utilizando diferentes concentrações de composto (2 – 8 µM) para um tempo de exposição de 48 h. O uso de análise multivariada dos dados obtidos permitiu identificar um nítido efeito dependente da concentração, tal como discriminar entre células controlo e células tratadas, assim como o impacto dos diferentes agentes testados – Pt(II) vs Pd(II) e mononuclear (cisplatina) vs polinuclear (Pt2Spm and Pd2Spm). Foram identificados biomarcadores espectrais da ação destes compostos, assim como a resposta celular devida à perturbação quimioterapêutica. O efeito principal dos complexos estudados verificou-se ao nível do DNA, dos lípidos e das proteínas, tendo o agente de Pd(II) um impacto mais significativo nas proteínas enquanto que o seu homólogo de Pt(II) afetou mais os lípidos (mesmo a baixas concentrações). Os resultados obtidos sugerem a ocorrência de vias distintas e não convencionais de citotoxicidade para estes complexos dinucleares com poliaminas. As microespectroscopias de Raman e FTIR foram confirmadas como sendo técnicas potentes e não-invasivas para obtenção de assinaturas espectrais do impacto bioquímico e reação fisiológica das células a agentes anticancerígenos. Finalmente, é reportado o primeiro estudo por difração de neutrões em células humanas, que visa abordar o condicionamento do solvente a um fármaco através da análise da água intracelular com o intuito de verificar as variações provocadas pela exposição ao agente quimioterapêutico. As experiências de espectroscopia de difração de neutrões, inelástica e quase-elástica, com marcação isotópica foram realizadas de modo a monotorizar a resposta da água interfacial ao tratamento com cisplatina (8 e 20 µM) na mesma linha celular (MDA-MB231) previamente investigada. Foram também obtidos dados de espectroscopia vibracional ótica para as células liofilizadas. Verificou-se que o comportamento da água intracelular na presença da cisplatina foi diferente do da água livre de constrangimentos, assim como da água citoplasmática em células não tratadas. As alterações dinâmicas dependentes da concentração evidenciaram uma redução de mobilidade progressiva (e dependente da concentração) entre as amostras não tratadas e as expostas à cisplatina, observadas em simultâneo às variações na estrutura nativa das moléculas de água no meio intracelular, como consequência da ação do fármaco. Os resultados obtidos permitiram obter uma imagem clara da resposta à cisplatina por parte da água intracelular, sendo esta a primeira prova experimental, mediante o uso de técnicas espectroscópicas com neutrões, do impacto de um fármaco na matriz celular. Este é um modo inovador de abordar a farmacodinâmica de um agente quimioterapêutico, na busca de recetores alternativos (alvos terapêuticos secundários)