Ecoimmunology perspective of host-parasite interactions in Limosa limosa across its migratory flyway

Tese de doutoramento em Biociências, na especialidade de Ecologia, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraFor long-distance migrant birds, ecological changes along the flyway and strenuous work, can unbalance immune investments and thereby increasing the vulnerability to disease and reducing survival. Despite an essential self-maintenance component, immunity comes with costs as well as benefits. At an ecological context (i.e. limited energy), trade-offs are generated between immunity and other competing physiological components, leading to variations on immune response across time (annual-cycle) and space (different environments). Moreover, immune responses also vary between species and are optimized according to specific situations of an individual´s life, to maximize survival and fitness. Many ecoimmunology studies are focused on understanding the general patterns of immune responses in free-living birds, and what mechanisms mediate the changes in disease susceptibility, which in turn may affect population dynamics and survival. Information regarding these immunologic trade-offs remain largely unknown, and thus becoming of paramount importance when contextualized with climate change effects over migration ecology and the distribution of animal diseases. The work comprised in this thesis addressed the general question of how differences in environmental pathogen pressure shape the innate and adaptive immunity of a free-living bird species. The long-distance migrant Black-tailed godwit (Limosa limosa; hereafter godwit), was used as a study model, since the two subspecies, nominate (Limosa limosa limosa) and Icelandic (L. l. islandica), vary on migratory strategy and habitat-use, which consequently differ in pathogen pressure. Below, I summarize the main contributions of my work for the ecoimmunology research area. On chapter I, I tested whether the strength of immune response is indeed correlated with the environmental pathogen risk that differ with the migratory strategies and habitat use of godwit´s. The work focused innate baseline immunity parameters and I showed that it changes during the annual cycle of godwits in response to seasonal demands, availability of resources and physiological trade-offs. The investments in immune defence and the strategies deployed also varied in response to risk of getting infected. Trade-offs between innate immunity and other physiological components were more apparent during energetically demanding periods, such as the breeding season. For e.g. the Icelandic godwits downregulated innate responses when occupying parasite-poor breeding areas. Moreover, data indicates that immune adjustments and strategies are rather unique for each species. Nonetheless, migration seems to affect several bird species the same way, leading to an overall immunosuppression of the innate immune response and possibly to a higher vulnerability to disease. On chapter II, the MHC-I gene of the Icelandic godwit is characterized based on Sanger and ultradeep Illumina MiSeq sequencing. Characterization mostly focused the α2 domain (exon 3) of this gene, which is known to be highly polymorphic and for coding the proteins that recognize pathogens. I found 47 new alleles of MHC-I exon 3 and of a putatively classical nature (functional). Individuals had between one to four loci, with at least three being expressed. The gene organization was quite similar to their closest relative, the Red knots (Calidris canutus), but comparing to other Charadriiformes species, the alleles had a lower polymorphism and few sites subjected to positive selection. This pattern most likely reflects the lower pathogenic pressure that individuals experience along their migratory flyway. On chapter III, the role of pathogens as drivers of the diversifying selection of MHC genes is analysed. By using Illumina MiSeq sequencing we compared two godwit subspecies in terms of MHC-I exon 3 diversity and polymorphism. Both nominate and Icelandic godwits overlapped in terms of number of alleles (and loci) per individual, but nominate birds had significantly higher number of alleles and polymorphism. A population size effect could partly explain the differences seen between subspecies at the MHC-I diversity, but the number of positively selected sites for the nominate godwit was twice as high as those found for the Icelandic godwits. Positive selection differences suggest a stronger balancing selection for the nominate godwit and thus an adaptation to pathogen-rich habitats. Chapter IV is focus on sexual signals and whether they truly advertise the quality of mates and their capacity to fight-off pathogens. I tested whether investment on innate immunity could be reflected by the sexual characters of godwits. Results indicate that some plumage features of male and female godwits were linked to soluble parameters of innate immunity and were not cost-free. Moreover, the signal was honest for males but not for females, a difference that may be related to sex-specific energetic demands and roles undertaken in breeding. Results suggest that females select males that are better at combining moult and migration and more able to fight infections. Chapter V tackles a more pratical issue faced by researchers that work with free-living birds, and with no immediate access to laboratory facilities. Immunological assays have become a widespread tool for an integrate approach of immune variation, but it was unknown whether post-sampling repeated freeze-thawing (FT) cycles could affect the final outcome of the assays. An experimental approach testing post-sampling handling and methodological issues was implemented, and overall results showed that plasma (and serum) samples remain stable after repeated FT cycles, and thus the indices of immune function are mostly unaffected. Moreover, small methodological deviations of the assay´s protocols, caused no substantial variations on the final results.Para aves migradoras de longa distância, as mudanças ecológicas ao longo da migração, aliadas ao esforço físico, podem desequilibrar os investimentos em imunidade, levando a uma maior a vulnerabilidade à doença e reduzindo a capacidade de sobrevivência. Apesar de a imunidade ser um componente fisiológico de auto-preservação, esta implica custos bem como benefícios. Num contexto ecológico (ex. energia limitada), são gerados trade-offs entre a imunidade e outros componentes fisiológicos, dando origem a variações da resposta imune ao longo do tempo (ciclo anual) e do espaço (diferentes habitats). Para além disso, as respostas imunitárias também variam entre espécies e são optimizadas em função de situações específicas da vida de um indivíduo para maximizar a sobrevivência e o fitness. Muitos estudos em ecoimunologia focam-se na compreensão dos padrões globais de respostas imunes em aves selvagens e nos mecanismos que alteram a susceptibilidade à doença, o que consequentemente poderá afectar a sobrevivência e a dinâmica populacional. Infelizmente a informação relativa a estes trade-offs imunológicos permanece maioritariamente desconhecida, tratando-se portanto de conhecimento essencial quando contextualizado com os efeitos das alterações climáticas sobre a ecologia das migrações e distribuição de doenças animais. O trabalho englobado nesta tese procurou responder como é que as diferenças na pressão parasítica ambiental afectam a imunidade inata e adaptativa de aves selvagens. O migrador de longa distância Maçarico-de-bico-direito (Limosa limosa; Maçarico), foi usado como modelo de estudo, uma vez que duas das suas subespécies, nominal (Limosa limosa limosa) e islandesa (L. l. Islandica), variam na estratégia migratória e uso de habitat, que consequentemente difere na pressão parasítica. De seguida, resumo as principais contribuições do meu trabalho para a área da ecoimunologia. No capítulo I, usando uma ave límicola como modelo, testei se a capacidade da resposta imune está de facto correlacionada com o risco de contrair doenças, uma vez que o risco difere com as estratégias de migração e habitat. O trabalho focou parâmetros de imunidade inata e demonstrei que esta não é de natureza estanque, mas que varia ao longo do ciclo anual dos Maçaricos em resposta à estação do ano, disponibilidade de recursos e trade-offs fisiológicos. Os investimentos na imunidade e estratégias aplicadas também variaram em resposta ao risco de infecção. Os trade-offs entre a imunidade e outros componentes fisiológicos, tornaram-se mais evidentes durante períodos energeticamente exigentes, como a reprodução. Por exemplo, neste período a subespécie islandesa suprimiu alguns componentes da imunidade inata, quando ocupava áreas onde o risco de infecção é baixo. Os resultados também indicam que os ajustes e estratégias imunitárias são únicas para cada espécie. Contudo a migração parece afectar as variadas espécies de aves da mesma maneira, dando origem a uma imunosupressão geral da resposta inata e possivelmente a uma maior vulnerabilidade à doença. No capítulo II, o gene MHC-I da subespécie islandesa de Maçarico foi caracterizado com o auxílio da sequenciação de Sanger e Illumina MiSeq. A caracterização focou quase exclusivamente o domínio α2 (exão 3) deste gene, que é conhecido pelo seu polimorfismo e por codificar parte das glicoproteínas que reconhecem agentes patogénicos. Neste trabalho descobri 47 novos alelos do gene MHC-I, todos eles de natureza provavelmente clássica (ou funcional). Os Maçaricos islandeses têm entre um e quatro loci, com pelo menos três a ser expressos. A organização do gene MHC-I é bastante semelhante à do seu parente mais próximo, a Seixoeira (Calidris canutus), mas comparado com outras espécies de Charadriiformes, os alelos tinham um polimorfismo menor e poucos locais sujeitos a selecção positiva. Este padrão parece ser um reflexo de os indivíduos experienciarem a uma menor pressão patogénica ao longo da sua rota de migração. No capítulo III, aprofundámos o papel da pressão patogénica como origem da diversificação dos genes MHC. Com o auxílio da sequenciação Illumina MiSeq, comparámos as duas subespécies de Maçarico relativamente à diversidade e ao polimorfismo do exão 3 do gene MHC-I. Ambas as subespécies sobrepuseram-se no que toca ao número de alelos (e loci) por indivíduo, mas a subespécie nominal, tinha significativamente mais alelos e tendencialmente um maior polimorfismo. Diferentes tamanhos populacionais poderão explicar parcialmente as diferenças encontradas entre subespécies ao nível da diversidade genética, no entanto, o número de locais sujeitos a selecção positiva encontrados para a subespécie nominal, foi duas vezes superior ao encontrado para a subespécie islandesa. As diferenças no que toca à selecção positiva, sugerem que a selecção natural é mais forte para a subespécie nominal e portanto uma adaptação a habitats ricos em parasitas. O capítulo IV centra-se nos sinais sexuais e avalia se eles realmente reflectem a qualidade dos parceiros e a sua capacidade em combater doenças. Para isso testei se o investimento na imunidade inata poderia ser reflectido pelos carácteres sexuais secundários da plumagem dos Maçaricos. Os resultados indicam que algumas características da plumagem dos machos e fêmeas estão ligadas a componentes solúveis de imunidade inata e que os investimentos na plumagem são custosos. Para além disso, o sinal foi honesto para os machos, mas não para as fêmeas, uma diferença que poderá estar relacionada com constrangimentos energéticos específicos para cada sexo, e pelos papéis desempenhados durante a reprodução. Em resumo, os dados indicam que as fêmeas seleccionam não só os machos que são melhores a combinar a muda da plumagem e a migração, mas também os mais competentes no combate às infecções. O Capítulo V aborda uma questão mais prática enfrentada por investigadores que trabalham com aves selvagens e sem acesso fácil ou imediato ao laboratório. Os ensaios imunológicos tornaram-se uma ferramenta generalizada para uma abordagem integrada da imunidade, mas desconhecia-se até à data se os ciclos repetidos de congelamento-descongelamento (CD) pós-amostragem poderiam afectar o resultado final dos ensaios imunológicos. Neste trabalho foi implementada uma abordagem experimental para o tratamento pós amostragem, bem como outras questões metodológicas, e os resultados indicaram que as amostras de plasma (ou soro) permanecem estáveis após ciclos repetidos de CD e que portanto, os componentes imunológicos permanecem inalterados. Mostrámos também que pequenas alterações metodológicas nos protocolos destes ensaios não causaram variações substanciais nos resultados finais.GHTM, IHMT, UNL – Global Health and Tropical Medicine, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade Nova de LisboaThe Ruffords Foundatio