Produção e purificação de vetores virais adeno-associados para terapia génica

Monografia realizada no âmbito da unidade Estágio Curricular do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de CoimbraA terapia génica apresenta-se atualmente como uma tecnologia em saúde muito inovadora e atrativa pelo facto de recorrendo à utilização de ácidos nucleicos se propor a cura de doenças mediante intervenção nas sua causas moleculares. A correção de determinada deficiência genética é feita mediante a entrega de um gene saudável através de um vetor. Os vírus adeno-associados, com mais de 100 tipos séricos identificados, apresentam-se como um tipo de vetores virais extensamente utilizados, com muitas vantagens para a utilização clínica dada a sua capacidade de mediar a expressão prolongada do transgene, a ausência de capacidade de replicação na ausência de um vírus auxiliar, a capacidade de transdução tanto em células em divisão como em células que não se dividam e ainda ausência de patogenicidade na infeção pelo vírus selvagem. Os métodos de produção assentam em quatro métodos principais que diferem na metodologia de inserção nas células produtoras dos genes que codificam os diferentes componentes das partículas virais: 1. a transfeção ou introdução transiente de plasmídeos em células eucarióticas, 2. a utilização de linhas celulares estáveis mediante integração dos genes virais no seu genoma, 3. o sistema vetorial de expressão de baculovírus em que são infetadas células de inseto por baculovírus que codificam os genes virais e finalmente, 4. os sistemas de infeção baseados em rHSV em que células eucariotas são infetadas por HSV recombinantes que codificam para os genes virais. Com vista à obtenção de preparações com elevada pureza encontram-se em desenvolvimento diversos processos de purificação, envolvendo sobretudo técnicas de ultracentrifugação com gradientes de iodixanol ou cloreto de césio, que se pensa que venham a cair em desuso em favor de técnicas de cromatografia de afinidade ou troca iónica, que se apresentam como mais promissoras. A determinação do título das preparações virais é fundamental no estabelecimento da dose terapêutica. Os métodos de determinação do título assentam na medição de três características dos vetores, a infetividade, a expressão génica e contagem direta das partículas. Os métodos que assentam na medição da infetividade ou da expressão génica, avaliam o desempenho da preparação in vivo, no entanto são mais trabalhosos e demorados. O Virus Counter, Nanoparticle Tracking Analysis e o Tunable Resistive Pulse Sensing são técnicas automatizadas que assentam na contagem física das partículas com recurso a equipamentos específicos e revelaram ser rápidas, com baixo custo e apresentarem resultados com excelente reprodutibilidade.Gene therapy presents itself today as very innovative and attractive technology given its promise to cure diseases by targeting its genetic causes. The correction of specific genetic defects is made by delivery of a healthy gene copy or a silencing sequence through the use of a vector. Adeno-associated viruses, with over 100 identified serum types are presented as a promising type of viral vectors widely used with many advantages for clinical use given its ability to mediate long-term transgene expression, lack of replication in absence of a helper virus, transduction capacity both in dividing cells and in cells that do not divide, and the absence of pathogenicity upon infection by the wild-type virus. Production methods are based in four main strategies: 1. transfection of packaging plasmids into eukaryotic cells that will produce the vectors, 2. Stable integration of the viral genes within the genome of packaging of cell lines, 3. vector baculovirus expression system where packaging insect cells are infected with baculovirus carrying viral genes, and 4. rHSV infection-based systems wherein eukaryotic cells are infected with HSV recombinant containing the viral genes. In order to obtain a preparation of high purity several purification processes are being tested and developed involving mainly techniques of ultrafiltration by iodixanol gradients or cesium chloride, which will probably fall into disuse given the rise of promising affinity or ion exchange chromatography techniques. The titration is fundamental to establish the therapeutic dose. The titration methods are based on measurement of either infectivity, gene expression or direct counting of the viral particles. The methods based on measurement of infectivity or gene expression, evaluate the performance of the in vivo preparation, but are more laborious and time-consuming. Automated counting techniques, such as the Virus Counter, Nanoparticle Tracking Analysis or the Tunable Resistive Pulse Sensing are based on the physical counting of the particles using a specific equipment and turn out to be very fast, of low cost, presenting results with excellent reproducibility