Deteção de DNA de ruminante por RT-PCR em alimentos para animais : implementação e validação do método PCR em tempo real na deteção proteínas animais transformadas em alimentos para animais

Dissertação de Mestrado em Segurança Alimentar apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de CoimbraA encefalopatia espongiforme bovina é uma doença priónica que consiste numa desordem neurológica, progressiva e fatal, que afeta os bovinos. Conhecida na década de 1980 na Europa, na década de 90 chamou a atenção como nova variante da doença de Creutzfeldt- Jakob em seres humanos. Encefalopatia espongiforme bovina tem uma origem alimentar, propagando-se através da incorporação de farinhas de carne e ossos contaminados, provenientes da reciclagem de restos de animais mortos expostos ao agente infecioso (prião), nas rações. Foram criadas medidas para garantir a proteção da saúde pública nomeadamente a remoção de matérias de riscos específicos e a restrição à utilização de certas proteínas animais transformadas na alimentação de animais de criação (Feed Ban) e, em paralelo, aplicaram-se os métodos para garantir o cumprimento das respetivas proibições. A microscopia clássica era até há pouco tempo o único método oficial utilizado para o controlo das proteínas animais transformadas em alimentos para animais de criação na Europa. Com a aprovação da utilização de monogástricos na alimentação dos peixes de aquacultura, o método da reação da polimerase em cadeia em tempo real, para deteção de proteínas animais transformadas ruminantes, foi aprovado como método oficial. Este trabalho teve como objetivo o estudo dos limites de deteção do método da reação da polimerase em cadeia em tempo real na identificação de ácido desoxirribonucleico de ruminantes em rações de animais, em Portugal. Para tal procedeu-se à incorporação de farinhas de carne e ossos, em diferentes concentrações, em alimentos compostos para animais e em matérias-primas utilizadas na sua elaboração, simulando diferentes níveis de contaminação possíveis. Simultaneamente fez-se a análise de microscopia clássica, por forma a comparar estes resultados e limites de deteção. Foi possível verificar um limite de deteção de 0,1% de incorporação para ambos os métodos.Bovine spongiform encephalopathy is a prion disease that is a neurological, progressive and fatal disorder that affects cattle. Known since the 1980s in Europe, in the 90s it gained attention as new variant of Creutzfeldt-Jakob disease in humans. Bovine spongiform encephalopathy has a food source, spreaded by incorporation of meat and bone meal contaminated from recycling remains of dead animals exposed to the infectious agent (prion) in diets. Some measures were designed to ensure the protection of public health, in particular, the removal of specified risk materials and restriction of use of certain processed animal proteins in feed for farmed animals (Feed Ban) and, parallel, usage of methods to ensure compliance with the respective bans. The classical microscopy was until recently the only official method used for the control of processed animal proteins in feed for farmed animals in Europe. With the approval of the use of monogastric feeding fish aquaculture, real-time polymerase chain reaction method for detection of ruminant’s deoxyribonucleic acid was approved as an official method. This work aimed to study the detection limits of real-time polymerase chain reaction products in the identification of ruminant processed animal proteins in animal feed, in Portugal. To do so, meat and bones were incorporated in different concentrations in compound feeds and raw materials used in their manufacture, simulating different levels of possible contamination. Simultaneously, classical microscopy was performed in order to compare these results with those obtained through polymerase chain reaction in what concerns the detection limit. It was possible to check a detection limit of 0.1% of incorporation for both methods